實用免疫細(xì)胞與核酸:第二節(jié)　免疫細(xì)胞化學(xué)的有關(guān)技術(shù)概述

根據(jù)標(biāo)記物的不同，免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)可分為免疫熒光細(xì)胞化學(xué)技術(shù)，免疫酶細(xì)胞化學(xué)技術(shù)，免疫鐵蛋白技術(shù)，免疫金-銀細(xì)胞化學(xué)技術(shù)，親和免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)，免疫電子顯微鏡技術(shù)等。近些年來，核酸分子原位雜交技術(shù)采用生物素、地高辛等非放射性物質(zhì)標(biāo)記探針，和免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)密切結(jié)合，發(fā)展為雜交免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)。不同的免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)，各具有獨特的試劑和方法，但其基本技術(shù)方法是相似的，都包括抗休的制備，組織材料的處理、免疫染色、對照試驗、顯微鏡觀察等步驟。還有雙重和多重標(biāo)記技術(shù)也有重要的用途。

一、抗體的制備和配制

（一)抗體的制備

這是免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)的首要試劑，必需制備具有很高特異性和敏感性的高效價抗體，這將在本書第二章　中詳述。目前國內(nèi)外市場各種特異性抗體日益增多，許多實驗室直接應(yīng)用市售產(chǎn)品，現(xiàn)在我國自制抗體種類少，發(fā)展抗體生產(chǎn)十分必要。尤其要定位一種新的抗原物質(zhì)，能夠自制較好。

（二)抗體的配制

包括抗體貯存液和抗體使用液的配制方法。新制備或購進(jìn)的是原液或凍干品，抗血清為全血清，單克隆抗體是培養(yǎng)上清液或腹水。

1．抗體貯存獲得新抗體后，應(yīng)先根據(jù)生產(chǎn)廠家提供的抗體效價，將其分裝，可每10μl或100μl/支分裝入安瓿或0.25ml帶蓋塑料管中，密封。放入-20。C~40。C冰箱中保存?zhèn)溆�，一般可保�?~2年。小量分裝的抗體可1次用完，避免反復(fù)凍融而影響效價的降低。一般用前新鮮配制使用液體，稀釋的抗體不能長時間保存，在4。C可存入1~3天，超過7天效價顯著降低。

2．抗體使用液的配制這是任何免疫細(xì)胞化學(xué)方法中最重要的一環(huán)，無論是一抗、二抗和各種標(biāo)記抗體，用前都必須按不同免疫染色方法和抗原性強(qiáng)弱與抗原的多少，稀釋使用的各種抗體原液，以便獲得最佳免疫染色結(jié)果。

（1)抗體最佳稀釋度的測定方法：用已知陽性抗原切片，進(jìn)行免疫染色，將其陽性強(qiáng)度與背景染色強(qiáng)度以“+”表示，可分為++++、+++、++、+、（-)。++++為最強(qiáng)陽性，+++為強(qiáng)陽性，++為較強(qiáng)陽性，+為弱陽性，（-)為陰性。

①直接測定法：用于測定第一抗體的最佳稀釋度，其它條件穩(wěn)定可靠。將一抗稀釋為1：50、1：100、1：2001：400、1：500等5個稀釋度滴加在陽性抗原切片上，同時設(shè)一替代和陰性對照，結(jié)果如表1-1：

表 1-1 選擇最佳稀釋抗血清方法

從表中結(jié)果可見，第一抗體稀釋到1：400時陽性結(jié)果呈強(qiáng)陽性，背景染色減少，其最佳稀釋度在1：400~500之間。再作1：420、1：440、1：460、1：480、1：500稀釋后染色，找出最佳稀釋度。

②棋盤（方陣)測定方法：當(dāng)測定兩種以上抗體的最佳配合稀釋度時，必須采用此法（見表1-2)。

表1-2 兩種以上抗體最佳配合稀釋度選擇表

括號內(nèi)為背景染色結(jié)果

從表中可見第一抗體1：1000，第二抗體1：2000接近最佳稀釋度，再將一 抗體作1：600、1：700、1：800、1：900和1：1000稀釋，即可找出最佳稀釋度。

（2)抗體稀釋液的配制：常用0.01mol/l pH7.4PBS或TBS緩沖液作抗體稀釋液�？捎靡韵路椒ㄅ渲茖Ｓ玫目贵w稀釋液，防止抗體效價下降，減少抗體在組織上的非特異性吸附：取0.05mol/l pH7.4 TBS100ml，加溫到60。C，再加入優(yōu)質(zhì)明膠100mg，攪拌溶解后，冷卻至室溫，加入1g牛血清白蛋白，加入NaN3200mg溶解后，過濾，分裝，4。C保存。

抗體的最佳稀釋度由于各種抗體的效價不同，組織中抗原強(qiáng)弱不一，應(yīng)根據(jù)不同情況作適當(dāng)?shù)恼{(diào)整，以取得中等陽性稀釋度為佳，因其既適合于抗原性強(qiáng)和含量多的標(biāo)本，也可用于抗原性弱的標(biāo)本。

二、組織材料的處理

組織材料的處理是獲得良好免疫組織化學(xué)結(jié)果的前提，必需保證要檢測的細(xì)胞或組織取材新鮮，固定及時，形態(tài)保存完好，抗原物質(zhì)的抗原性不丟失、不擴(kuò)散和被破壞（下節(jié)　詳述)。

三、免疫染色

可在細(xì)胞涂片或組織切片上進(jìn)行免疫染色。一般程序是：①標(biāo)記抗體與標(biāo)本中抗原反應(yīng)結(jié)合；②用PBS洗去未結(jié)合的成分；③直接觀察結(jié)果（免疫熒光直接法)；或顯色后再用顯微鏡觀察（免疫酶直接法)。在此基礎(chǔ)上發(fā)展出間接法，多層法，雙標(biāo)記法等各種方法，將在本書各有關(guān)章　節(jié)　內(nèi)詳述。

在免疫染色中應(yīng)特別注意增強(qiáng)特異性染色，減少或消除非特異性染色。在各種免疫染色中都必須注意以下幾個問題：

1．增強(qiáng)特異性染色的方法

（1)蛋白酶消化法：其作用是暴露抗原，增加細(xì)胞和組織的通透性，以便抗體與抗原最大限度的結(jié)合，增強(qiáng)特異性染色和避免非特異性染色。這種方法已廣泛用于各種免疫細(xì)胞化學(xué)染色，常用的蛋白酶有胰蛋白酶、胃蛋白酶以及鏈霉蛋白酶（pronase)等；也可用3mol/L尿素處理切片，達(dá)到酶消化的目的。各種酶的配制和使用方法詳見附錄。酶消化的時間和溫度因各種抗原對消化的敏感性不同，應(yīng)根據(jù)酶的活性通過預(yù)試驗確定，消化的時間還與組織固定的時間有關(guān)，一般是陳舊固定組織所需時間長，以37。C為宜。消化時間短的組織可在室溫中進(jìn)行。消化處理時間過長能損傷組織，易使切片脫落，應(yīng)使用切片粘附劑，消化時間盡量縮短。

（2)合適的抗體稀釋zxtf.net.cn/wszg/度：抗體的濃度是免疫染色的關(guān)鍵，如果抗體濃度過高，抗體分子過多于抗原決定簇，可導(dǎo)致抗體結(jié)合減少，產(chǎn)生陰性結(jié)果。此陰性結(jié)果并不一定缺少抗原，而是由于抗體過量。這種現(xiàn)象類似于凝集反應(yīng)中的前帶效應(yīng)（Prozone effect )。因此，必須使用一系列稀釋作“棋盤式效價滴定”檢測抗體的合適稀釋度，以得到最大強(qiáng)度的特異性染色和最弱的背景染色�？贵w稀釋度應(yīng)根據(jù)：①抗體效價高，溶液中特異性抗體濃度越高，工作稀釋度越高；②一般講，應(yīng)用的抗體稀釋度越大，溫育時間越長。③抗體中非特異性蛋白含量、只有高稀釋度時才能防止非特異性背景染色；④稀釋用緩沖液的種類、標(biāo)本的固定和處理過程等也可影響稀釋度。所以合適的稀釋度應(yīng)根據(jù)自己的情況測定�？贵w的稀釋主要是指第一抗體，因為第一抗體中特異性抗體合適的嘗試是關(guān)鍵,應(yīng)用高稀釋度第一抗體僅顯示主親和力的特異性染色反應(yīng),減少或消除其中交叉抗體反應(yīng)。

（3)溫育時間：大部分抗體溫育時間為30-60min，必要時可4。C過夜（約18h)。溫育的溫度常用37。C，也可在室溫中進(jìn)行，對抗原抗體反應(yīng)強(qiáng)的以室溫為佳。37。C可增強(qiáng)抗原抗體反應(yīng)；適用于多數(shù)抗體染色，但應(yīng)注意在濕盒中進(jìn)行，防止切片干燥而導(dǎo)致失敗。

（4)多層染色法：對弱的抗原可用間接法（雙層)、PAP和ABC法（三層)、四或五層PAP法或ABC法，或PAP和ABC聯(lián)合染色法等，可以很大程度的提高敏感性，獲得良好結(jié)果。

（5)顯色增敏劑的應(yīng)用，如在過氧化物酶底物中加入氯化鎳，可提高顯色敏感度4倍。

2．減少或消除非特異性染色的方法 組織中非抗原抗體反應(yīng)出現(xiàn)的陽性染色稱為非特異性背景染色，最常見的原因是蛋白吸附于高電荷的膠元和結(jié)締組織成分上。最有效方法是在用第一抗體前加制備第二抗體動物之非免疫血清（1：5-1：20)封閉組織上帶電荷基團(tuán)而除去與第一抗體非特異性結(jié)合。必要時可加入2%-5%牛血清白蛋白，可進(jìn)一步減少非特異性染色。作用時間為10-20min。也可用除制備第一抗體以外的其它動物血清（非免疫的)。有明顯溶血的血清不能用，以免產(chǎn)生非特異性染色。免疫熒光染色時，可用0.01%伊文氏蘭(PBS溶液)稀釋熒光抗體,對消除背景的非特異性熒光染色有很好的效果。當(dāng)然使用特異性高、效價高的第一抗體是最重要的條件。洗滌用的緩沖液中加入0.85%~1%NaCl成為高鹽溶液,充分洗滌切片,能有效的減少非特異性結(jié)合而減少背景染色。

3．顯色反應(yīng)的控制 免疫酶染色應(yīng)注意控制：①成色質(zhì)濃度和溫育時間可調(diào)節(jié)　，增加成色質(zhì)的量和/或增加底物溫育時間，可增加反應(yīng)產(chǎn)物強(qiáng)度。著色太深可減少溫育反應(yīng)時間。②過氧化物酶顯色時，H2O2較大濃度將使顯色反應(yīng)過快而致背景加深；過量H2O2可能抑制酶的活性。

4．復(fù)染 根據(jù)所用的染色方法和呈顯顏色等，可選用適當(dāng)?shù)膹?fù)染方法。如陽性結(jié)果呈紅或棕色，則用蘇木素將細(xì)胞核染成蘭色，以便定位檢測。也可用1%～2%甲基綠復(fù)染。

四、對照

其目的在于證明和肯定陽性結(jié)果的特異性，排除非特異性疑問。主要是針對第一抗體對照，常用的對照方法包括：①陽性對照；②陰性對照；③阻斷試驗；④替代對照；⑤空白對照；⑥自身對照；⑦吸收試驗。

（一)陽性對照

用已知抗原陽性的切片與待檢標(biāo)本同時進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色，對照zxtf.net.cn/shouyi/切片應(yīng)呈陽性結(jié)果，稱為陽性對照。證明全過程均符合要求，尤其當(dāng)待檢標(biāo)本呈陰性結(jié)果時，陽性對照尤為重要。

（二)陰性對照

用確證不含已知抗原的標(biāo)本作對照，應(yīng)呈陰性結(jié)果，稱陰性對照，是陰性對照的一種。其實空白、替代、吸收和抑制試驗都屬陰性對照。當(dāng)待檢標(biāo)本呈陽性結(jié)果時，陰性對照就更加重要，用以排除假陽性。對照的具體方法步驟，在有關(guān)章　節(jié)　詳述。

五、免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果的判斷

對免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果的判斷應(yīng)持科學(xué)的慎重態(tài)度，要準(zhǔn)確判斷陽性和陰性，排除假陽性和假陰性結(jié)果，必須嚴(yán)格對照實驗，對新發(fā)現(xiàn)的陽性結(jié)果，除有對照試驗結(jié)果之外，應(yīng)進(jìn)行多次重復(fù)實驗，要求用幾種方法進(jìn)行驗證，如用PAP法陽性，可再用ABC法驗證。必須學(xué)會判斷特異性染色和非特異性染色，對初學(xué)者更為重要，否則會得出不科學(xué)的結(jié)論。特異性染色與非特異性染色的鑒別點主要在于特異性反應(yīng)產(chǎn)物常分布于特定的部位，如胞漿內(nèi)，也有分布在細(xì)胞核和細(xì)胞表面的，即具有結(jié)構(gòu)性。特異性染色表現(xiàn)為在同一切片上呈現(xiàn)不同程度的陽性染色結(jié)果。非特異性染色表現(xiàn)為無一定的分布規(guī)律，常為某一部位成片的均勻著色，細(xì)胞和周圍的結(jié)締組織均無區(qū)別的著色，或結(jié)締組織呈現(xiàn)很強(qiáng)的染色。非特異性染色常出現(xiàn)在干燥切片的邊緣，有刀痕或組織折疊的部位。在過大的組織塊，中心固定不良也會導(dǎo)致非特異性染色。有時可見非特異性染色和特異性染色同時存在，由于過強(qiáng)的非特異性染色背景不但影響對特異性染色結(jié)果的觀察和記錄，而且令人對其特異性結(jié)果產(chǎn)生懷疑。

（一)陽性細(xì)胞的染色特征

免疫細(xì)胞化學(xué)的呈色深淺可反映抗原存在的數(shù)量，可作為定性、定位和定量的依據(jù)。

（1)陽性細(xì)胞染色分布有三種類型：①胞漿；②細(xì)胞核；③細(xì)胞膜表面。大部分抗原見于細(xì)胞漿，可見于整個胞漿或部分胞漿。

（2)陽性細(xì)胞分布可分為煙性和彌漫性。

（3)由于細(xì)胞內(nèi)含抗原量的不同，所以染色強(qiáng)度不一。如果細(xì)胞之間染色強(qiáng)度相同，常提示其反應(yīng)為非特異性。

（4)陽性細(xì)胞染色定位于細(xì)胞，且與陰性細(xì)胞相互交雜分布；而非特異性染色常不限于單個細(xì)胞，而是累及一片細(xì)胞。

（5)切片邊緣、刀痕或皺折區(qū)域，壞死或擠壓的細(xì)胞區(qū)，膠原結(jié)締組織等，常表現(xiàn)為相同的陽性染色強(qiáng)度，不能用于判斷陽性。

（二)染色失敗的幾種原因

（1)所染的全部切片均為陰性結(jié)果：包括陽性對照在內(nèi)，全部呈陰性反應(yīng)，原因可能是：①染色未嚴(yán)格按操作步驟進(jìn)行；②漏加一種抗體，或抗體失效；③緩沖液內(nèi)含疊氮化鈉，抑制了酶的活性；④底物中所加H2O2量少或失效；⑤復(fù)染或脫水劑使用不當(dāng)。

（2)所有切片均呈弱陽性反應(yīng)：①切片在染色過程中抗體過濃，或干燥了；②緩沖液配制中未加氯化鈉和pH值不準(zhǔn)確，洗滌不徹底；③使用已變色的呈色底物溶液，或呈色反應(yīng)時間過長；④抗體溫育的時間過長；⑤H2O2濃度過高，呈色速度過快；⑥粘附劑太厚。

（3)所有切片背景過深；①未用酶消化處理切片；②切片或涂片過厚；③漂洗不夠；④底物呈色反應(yīng)過久；⑤蛋白質(zhì)封閉不夠或所用血清溶血；⑥使用全血清抗體稀釋不夠。

（4)陽性對照染色良好，檢測的陽性標(biāo)本呈陰性反應(yīng)，固定和處理不當(dāng)是最常見的原因。

對于陽性結(jié)果的定量判斷常規(guī)方法是根據(jù)呈色深淺和陽性細(xì)胞數(shù)量分類計數(shù)，以（-)、+、++、+++等分級和計數(shù)統(tǒng)計�，F(xiàn)在已采用圖象分析計量，本書第九章　將詳細(xì)敘述這種使免疫細(xì)胞化學(xué)的定量成為可能的先進(jìn)的形態(tài)定量方法。另外，第十章　將詳細(xì)途述另一種先進(jìn)的免疫細(xì)胞化學(xué)計量分類術(shù)－流式細(xì)胞光度計技術(shù)。