放射免疫分析時(shí)加入的抗原和抗體的量極微，反應(yīng)所形成的復(fù)合物并不能成為肉眼所能辨認(rèn)的不溶性沉淀物，但是放射免疫分析必須分別測量與抗體結(jié)合的（B)和游離的（F)抗原，所以，B、F的分離是放射免疫分析中的一個(gè)重要環(huán)節(jié) 。根據(jù)抗原—抗體復(fù)合物與游離抗原理化性質(zhì)或免疫學(xué)性質(zhì)的不同，可采取各種分離技術(shù)。
分離方法的選擇直接影響分析的質(zhì)量，通常需滿足以下要求：
①使B和F分離完全；②不受外界因素的干擾而影響分離效果；③與游離抗原的非特異性作用盡可能��；④操作簡便，分離迅速，重復(fù)性好，適用于大量樣品分析；⑤來源廣，價(jià)格低廉，便于使用，適合RIA技術(shù)自動(dòng)化。
目前用于放射免疫測定中的分離方法很多，各有其優(yōu)缺點(diǎn)，下面介紹幾種常見的分離方法：
（1)吸附分離（固相顆粒)
活性碳吸附劑（目前常用)
硅鎂吸附劑（滑石粉等)
交換樹脂吸附劑
（2)蛋白沉淀劑
硫酸銨、硫酸鈉
聚乙二醇（PEG)（目前常用)
無水乙醇、丙醇等
（3)免疫分離劑（第二抗體)
（4)磁性分離劑
磁化活性碳吸附劑
磁化固相抗體
（5)固相包被分離法（固相分離劑包被在測試管內(nèi))
（一)吸附分離法
這種吸附分離劑是固相顆粒，它可以從反應(yīng)液中吸附游離抗原。
活性炭是常用的吸附劑。活性炭多用于小分子游離抗原和抗原—抗體復(fù)合物的分離。具體應(yīng)用時(shí)在活懷炭顆粒的表面涂上一層右旋糖酐或蛋白類化合物。這樣活性炭末的表面構(gòu)成一定大小的孔洞，在反應(yīng)液中加入這種特殊顆粒的混懸液時(shí)，小分子的游離抗原被活性炭吸附，達(dá)到分離B與F的目的。
活性炭吸附方法的優(yōu)點(diǎn)是操作簡便、價(jià)廉，缺點(diǎn)是離心沉淀部分是F而不是B，不適用目前自動(dòng)化放免測定，分離時(shí)易受溫度和時(shí)間的影響。
（二)沉淀分離法
沉淀分離法的原理，是鹽類或有機(jī)溶劑能夠破壞蛋白質(zhì)分子表面的水化層而發(fā)生沉淀（這種分離要求蛋白質(zhì)分子處在等電點(diǎn)環(huán)境中)。常用的沉淀劑是聚乙二醇（PEG)。PEG是一種直鏈大分子聚合物，使用PEG溶液時(shí)分離沉淀是在有載體血清蛋白或丙種蛋白存在，而且要求γ球蛋白的最終濃度達(dá)250mg/ml以上的情況下才能實(shí)現(xiàn)。PEG沉淀的結(jié)果易受過量的脂類或離心溫度的變化影響，PEG離心溫度在20℃以下進(jìn)行。PEG沉淀的優(yōu)點(diǎn)是PEG價(jià)格低廉，操作簡便，一次可處理大量樣品。其缺點(diǎn)是PEG單獨(dú)使用時(shí)非特異結(jié)合高，所以常與其它方法聯(lián)合使用；其分離效果易受pH、溫度等影響。
（三)雙抗體分離法
雙抗體分離法也稱免疫分離法，是特異性分離，應(yīng)用十分普遍。本法是以抗IgG抗體和可溶性的抗原-抗體復(fù)合物結(jié)合，形成很大的復(fù)合物而沉淀。很多抗原的特異抗體來自家兔或豚鼠，稱為第一抗體，形成的復(fù)合物不能通過離心將其沉淀�；�?qū)⒌谝豢贵w的同種正常動(dòng)物的血清IgG免疫另一種動(dòng)物所制得的抗體為第二抗體，該抗體與第一抗體形成不可溶的復(fù)合物，經(jīng)離心可將其沉淀，從而達(dá)到分離的目的（圖8-6)。
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圖8-6 雙抗體法分離原理模式圖
第二抗體分離的優(yōu)點(diǎn)是重復(fù)性好，B和F分離較為完全，非特異結(jié)合低，可同時(shí)處理大量樣品，使用方便。缺點(diǎn)是分離時(shí)間長，非特異性結(jié)合可有較大的波動(dòng)，第二抗體用量較大。
（四)磁性分離法
1975年，Hersh報(bào)道了用磁化分離技術(shù)分離血清狄高辛放免測定的B、F后，受到了廣泛的重視。近年來國內(nèi)外許多學(xué)者對(duì)磁化顆粒的制備進(jìn)行了系統(tǒng)地研究，應(yīng)用于B與F的分離，并取得了引人注目的進(jìn)展，使放免的B、F分離不再使用離心，縮短了放免操作zxtf.net.cn/wszg/時(shí)間，便于放免自動(dòng)化測量。磁性分離的具體原理為血清樣品與標(biāo)準(zhǔn)品中的抗原與磁顆粒上的一定量的抗體反應(yīng)，產(chǎn)生的抗原抗體磁性顆粒復(fù)合物，在磁場作用下沉降，使結(jié)合部分與游離部分分離。在磁性分離器上棄上清，進(jìn)行測量。優(yōu)點(diǎn)是簡化了操作程序，B、F分離也較完全，穩(wěn)定性好。
目前常用的磁性分離技術(shù)除磁性固相抗體外，還有磁化活性炭吸附分離劑。
（五)固相包被分離法
近年來由于固相技術(shù)的研究使其固相所被（埋)技術(shù)發(fā)展迅速，再有固相包被具有簡便、快速、穩(wěn)定、不需離心等優(yōu)點(diǎn)，有逐漸取代液相法的趨勢。
1990年，Causse報(bào)告了活化塑料管新技術(shù)及生物素結(jié)合抗體、親和素標(biāo)記物的應(yīng)用，使放免技術(shù)對(duì)多數(shù)微量物質(zhì)的檢測可達(dá)到10-15g級(jí)水平，大大提高了放免測定的精確度、靈敏度。
抗體包被：物理吸附法—方法簡便，但包被量低。
價(jià)鍵結(jié)合法—需要纖維素、瓊脂等固相載體，操作復(fù)雜。
Causse活化塑料管新技術(shù)，提高了包被量，主要特點(diǎn)是將順丁烯二酸酐和苯乙烯的共聚體涂布試管，在試管壁形成一層活性薄膜（這種方法操作簡便)。
（六)雙抗體+PEG的分離法
這種分離方法利用雙抗體特異性強(qiáng)、PEG沉淀簡便快速的優(yōu)點(diǎn)，從而克服了雙抗體時(shí)間長、PEG方法zxtf.net.cn非特異結(jié)合高的缺點(diǎn)。這一方面是當(dāng)前分離技術(shù)中較理想的一種方法。
這種聯(lián)合方法分離方法減少了第二抗體的用量，PEG的最終濃度也只需2～4%，成本較低。這種方法既適用于蛋白質(zhì)、酶、大分子物質(zhì)，又適用于小分子肽等半抗原物質(zhì)。
1991年，北京中國同位素公司北方免疫試劑所采用80年代法國廣泛應(yīng)用的雙抗體+PEG、再加一定劑量的γ球蛋白（免疫第二抗體時(shí)應(yīng)用的γ球蛋白)的分離劑，溶解于磷酸緩沖液中，pH在7.4左右。這種分離劑推廣應(yīng)用產(chǎn)生了很好的效果。沉淀完全，牢固，而非特異性結(jié)合低，時(shí)間短（加入分離劑15min后即可離心)，受溫度影響小，受到用戶的廣泛好評(píng)。
以上方法，要依據(jù)反應(yīng)液中反應(yīng)物分子量大小，酸堿度等特點(diǎn)，選擇合適的分離方法及分離劑。
