臨床生物化學(xué):第二節(jié)　常見遺傳性疾病的發(fā)生與基因診斷

一、血紅蛋白分子病

血紅蛋白由四種珠蛋白肽鏈組成，它們分別是α、β、δ和γ肽鏈，由它們不同的組合組成各種血紅蛋白。除α肽鏈的基因位于16號染色體外，其余β、δ、γ肽鏈的基因連鎖在11號染色體。血紅蛋白異常導(dǎo)致的分子病就是珠蛋白結(jié)構(gòu)基因的DNA分子結(jié)構(gòu)異常所致。

⒈點突變 DNA分子的堿基轉(zhuǎn)換或顛換造成單個堿基替代，導(dǎo)致三聯(lián)體遺傳密碼改變，使得相應(yīng)表達(dá)翻譯的肽鏈中氨基酸發(fā)生改變而導(dǎo)致蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)改變，最終引起該蛋白的生理功能發(fā)生改變。如β鏈第6位應(yīng)是谷氨酸，其對應(yīng)的堿基密碼是GAA，當(dāng)顛換成GUA時，表達(dá)的氨基酸改為纈氨酸，當(dāng)轉(zhuǎn)換成AAA時，表達(dá)的氨基酸改為賴氨酸。在目前發(fā)現(xiàn)的血紅蛋白異常中，絕大多數(shù)屬于這種類型。

⒉終止密碼子突變 mRNA翻譯蛋白質(zhì)的終止密碼有UAA、UAG、UGA。當(dāng)終止密碼子發(fā)生點突變，如UAA轉(zhuǎn)換為CAA時，終止密碼翻譯為谷胺酰胺，肽鏈無法終止導(dǎo)致肽鏈延長。相反，肽鏈中途某一密碼突變終止密碼時，肽鏈就提前終止變短。如在中國人中發(fā)現(xiàn)有β珠蛋白基因突變，使轉(zhuǎn)錄mRNA密碼子17由AAG→UAG，使翻譯的β珠蛋白過早終止，造成β鏈過短，而無正常功能，導(dǎo)致珠蛋白生成障礙性貧血發(fā)生。

⒊移碼突變 由于DNA分子三聯(lián)體密碼子之間是無標(biāo)點符號的，因此當(dāng)DNA的堿基序列中缺失或插入一個核苷酸，就相當(dāng)于多了或少了一個堿基，使得在突變位置以后的三聯(lián)體密碼子均依次發(fā)生變化，包括終止密碼。所以移碼突變可以是肽鏈的氨基酸發(fā)生改變，也可是肽鏈長短發(fā)生改變。而且這種突變位置越靠近翻譯起始端（5′端)其后果越嚴(yán)重。如在中國人中發(fā)現(xiàn)有β珠蛋白基因轉(zhuǎn)錄的密碼子41-42產(chǎn)生缺失，造成β鏈合成提前終止，這種β鏈不穩(wěn)定而導(dǎo)致β珠蛋白生成障礙性貧血發(fā)生。

突變類型檢測可用核酸測序，人工合成寡核苷酸探針作產(chǎn)前診斷。前者多用于研究，后者可應(yīng)用于臨床�，F(xiàn)可利用PCR法擴增突變區(qū)域，再行測序或雜交分析，大大提高了靈敏度和特異性，可省去目的基因的克隆，方法也得到一定的簡化。

⒋密碼子缺失和插入它與移碼突變不同的是生殖細(xì)胞在減數(shù)分裂時，染色單體發(fā)生錯配或不等交換，造成在基因DNA分子中，缺失或插入的核苷酸不是一個，而是一部分，即多了或少了一部分密碼子。當(dāng)然其肽鏈也相應(yīng)缺失或插入一個以上的氨基酸。如珠蛋白生成障礙性貧血發(fā)現(xiàn)二種類型，一種為右側(cè)缺失型，缺失了涉及α2和α1基因3.7kb的片段，而左側(cè)缺失型則缺失了α2及左側(cè)區(qū)域4.2kb的片段。（α2基因排列在左，α1基因排列在右)。該類變異可用Southern blot法，RFLP法加以診斷，參見診斷分子生物學(xué)基本技術(shù)有關(guān)章節(jié)。

⒌融合基因由于減數(shù)分裂時不同珠蛋白肽鏈的基因之間發(fā)生不等交換，結(jié)果造成某一珠蛋白基因同時融合兩種不同珠蛋白基因的部分堿基，由此合成的肽鏈也含有兩種不同珠蛋白的氨基酸序列。

血紅蛋白病的診斷可根據(jù)臨床癥狀，如溶血性貧血等現(xiàn)象。有些沒有臨床癥狀，須依賴實驗室診斷。在細(xì)胞水平可以通過血液學(xué)檢查，蛋白分子水平也可通過電泳，熱穩(wěn)定試驗等方法檢查。

血紅蛋白病的治療目前尚無根治辦法。該病的起因是基因突變所致，其治療有待于基因工程技術(shù)來矯正基因的缺陷，即用基因治療的方法加以根治。但要進行基因治療，必須建立完善基因診斷的技術(shù)，這是醫(yī)學(xué)檢驗工作者面臨的新課題。目前基因診斷技術(shù)可利用核酸探針進行分子雜交或進行核酸測定來分析基因突變和突變的位置。由于mRNA分子直接轉(zhuǎn)錄了DNA分子上基因的信息，又直接zxtf.net.cn/shouyi/指導(dǎo)蛋白質(zhì)合成，在細(xì)胞內(nèi)又有一定的量，故易于分離純化和分析，因此對內(nèi)源性基因的分析，其分析對象多為mRNA分子。mRNA分析最常使用的分子雜交技術(shù)有斑點雜交和Northern blot技術(shù)以及逆轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR)技術(shù)。

二、先天性代謝缺陷病

（一)苯丙酮尿癥

苯丙酮尿癥（PKU)因患者尿中含大量苯丙酮酸而得名病因是患者肝缺乏苯丙氨酸羥化酶，使由食物攝入體內(nèi)的苯丙酮酸不能正常代謝為酪氨酸，導(dǎo)致血清中苯丙氨酸濃度升高，可高達(dá)50-100mg/dl（正常參考值為1-3mg/dl)。大量的苯丙氨酸使旁路代謝活躍，經(jīng)苯丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶作用生成苯丙酮酸。

苯丙氨酸羥化酶是在肝細(xì)胞中合成的，即在肝細(xì)胞中專一表達(dá)而在胎兒的絨毛細(xì)胞或羊水細(xì)胞中并不表達(dá)，給PKU的產(chǎn)前診斷帶來了困難。

由于診斷分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，1983年胡流清等人完成了人苯丙氨酸羥化酶cDAN探針的制備。他們利用探針和Southern blot技術(shù)進行分子雜交，通過限制性片段長度多態(tài)性（restriction fragment-length polymerphism ，RFLP)分析實現(xiàn)了PKU的產(chǎn)前基因診斷。他們先用MSP-I限制性內(nèi)切酶消化正常人基因組DNA，經(jīng)核酸電泳后，將DNA片段轉(zhuǎn)移到一張硝酸纖維膜（或尼龍膜)上，再用32p標(biāo)記的人苯丙氨酸羥化酶cDNA探針雜交后，再經(jīng)放射自顯影技術(shù)顯示正常人群有23kb和19kb兩種限制性片段長度。同時他們調(diào)查了一個PKU家系，進行比較發(fā)現(xiàn)，同樣用Msp-I內(nèi)切酶消化，父母同時有23kb和19kb DNA，患兒只有19kb片段。說明在該家系中，苯丙氨酸羥化酶突變基因是與19kb片段連鎖的。連鎖簡而言之就是指同一條染色體上的基因聯(lián)合遺傳的現(xiàn)象。因此在該家系中的第2胎，如果只出現(xiàn)19kb DNA片段將是患兒，而同時出現(xiàn)23kb和19kb DNA片段或只出現(xiàn)23kbDNA片段的都是正常個體，而且只出現(xiàn)23kb DNA片段者不攜帶突變基因，不是突變基因的攜帶者。正常人出現(xiàn)19kb僅代表蛋白質(zhì)和酶的多態(tài)。PKU家系的患兒為19kb，正常兒為23kb說明該PKU家系的基因突變與19kb連鎖。（表15-2)

表15-2　人苯丙氨酸羧化酶基因核酸電泳與cDNA探針雜交自顯影

1986年胡流清等進一步證明苯丙氨酸羧化酶的表達(dá)異常是基因點突變所致，并確定了突變點位置，并由此設(shè)計了正常和突變的各含21個核苷酸的寡核苷酸探針。

↓

正常探針5′TCCATTAACAGTAAGTAATTT3′

突變探針5′TCCATTAACAATAAGTAATTTT3′

↑

用這兩個探針分別與PKU家系成員的DNA雜交，證實與正常探針雜交者為正常個體，與突變探針雜交者為患者，同時可與兩個探針雜交者為正常個體，但攜帶突變基因。此法已成功用于產(chǎn)前診斷。（圖15-1)

圖15-1　正常與突變苯丙氨酸羥化酶探針與PKU家系成員的DNA雜交結(jié)果

雜交技術(shù)由于費時、操作復(fù)雜而難以在基層實驗室推廣。現(xiàn)在多用聚酶鏈反應(yīng)（PCR)擴增技術(shù)進行基因診斷，或在PCR基礎(chǔ)上再進行探針雜交，在提高靈敏度的同時又提高特異性，而且快速、經(jīng)濟、簡便實用。

（二)嘌呤代謝紊亂與痛風(fēng)

尿酸是嘌呤核苷酸分解代謝的重要產(chǎn)物，血和尿中尿酸濃度的檢測是嘌呤代謝紊亂的重要化學(xué)指標(biāo)�？捎山�(jīng)典的磷鎢酸還原法和高度特異的尿酸酶等化學(xué)方法檢測。

健康成年男子每天約生成尿酸600-700mg，其中60％-70％經(jīng)腎排出，剩余約200mg排入腸道由細(xì)菌降解。體內(nèi)尿酸池維持在1200mg尿酸水平。腎排出尿酸的機制是由于尿酸分子量小（168u)，可全部經(jīng)腎小球濾過，但至少有98％被近曲小管重吸收，再經(jīng)遠(yuǎn)曲小管主動分泌，因此隨尿排出的尿酸主要由腎小管所分泌。腎每天約排出尿酸400-500mg（2.4-3.0mmol/L)，相當(dāng)于腎小球原濾液中含尿酸的4％-5％。

在血漿pH為7.4時，尿酸幾乎完全以單鈉尿酸鹽的形式存在，溶解度有限，約為0.42mmol/L（7.0mg/dl)；而尿酸的溶解度更低，在pH5的尿液中，比尿酸難溶20倍。健康成年男子的血清尿酸濃度約0.3mmol/L，女子約低20％。血清尿酸水平隨年齡增加而增高，男性比女性更明顯，可達(dá)0.46mmol/L。血清尿酸超過0.42mmol/L為高尿酸血癥（hyperuricemia)。在血清尿酸濃度超過尿酸鹽的溶解度時，就有可能尿酸鈉的針狀結(jié)晶沉淀于關(guān)節(jié)、肌腱、韌帶、腎錐體的間質(zhì)組織等軟組織。足夠數(shù)量的尿酸鹽結(jié)晶可引起急性炎癥反應(yīng)，如沉積于關(guān)節(jié)腔，形成急性關(guān)節(jié)炎。這是由于尿酸鹽結(jié)晶被白細(xì)胞吞噬后，破壞溶酶體膜，使膜內(nèi)酶釋放損傷白細(xì)胞和周圍組織，引起關(guān)節(jié)炎癥狀。表現(xiàn)為關(guān)節(jié)劇烈疼痛，反復(fù)發(fā)作，此即痛風(fēng)（gout)。沉積于軟組織的結(jié)晶稱為痛風(fēng)石，周圍發(fā)生炎癥反應(yīng)則構(gòu)成痛風(fēng)結(jié)節(jié)。原發(fā)痛風(fēng)可由于遺傳所致的核苷酸代謝中某一種酶表達(dá)異常所致，繼發(fā)性痛風(fēng)則繼發(fā)于多種疾病。繼發(fā)性病因可能有大量服用葡萄糖、果糖與甘露糖，使體內(nèi)嘌呤合成增加；或多發(fā)性骨髓瘤、紅細(xì)胞增多癥、惡性貧血、牛皮癬和廣泛轉(zhuǎn)移的惡性腫瘤，使核蛋白轉(zhuǎn)換率增快，而尿酸生成過多；或細(xì)胞毒藥物或放射治療時，核酸分解亢進使尿酸鹽進一步增高。

先天性遺傳原發(fā)通風(fēng)病因是次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（HGPRT)缺失所致，部分缺失時，臨床表現(xiàn)為尿酸過多的痛風(fēng)特征；當(dāng)完全缺失時，表現(xiàn)為高尿酸血癥、精神發(fā)育遲緩等特征的自毀容貌綜合征。

HGPRT蛋白質(zhì)分子為相同亞基的四聚體，每個亞基由217個氨基酸殘基組成。HG-PRT基因定位于X染色體長臂遠(yuǎn)端，因此該病表現(xiàn)為X連鎖。HGPRT基因長約34kb，而成熟的mRNA的長度只有1.6kb，可見DNA分子內(nèi)含有大量的內(nèi)含子。HGPRT的突變基因及表達(dá)產(chǎn)物（mRNA，蛋白質(zhì))已被分離、研究，和血紅蛋白一樣有許多突變類型，如有的109位絲氨酸被亮氨酸代替，有的103位絲氨酸被精氨酸代替，還有報告基因發(fā)生缺失、重排的嚴(yán)重發(fā)病患者。1983年Wilson等發(fā)現(xiàn)一例DNA上的TagI限制性內(nèi)切酶的切點發(fā)生突變，使在正常情況下可切出2.0kb片段的電泳區(qū)帶，由于切點突變而失去酶切作用，變成4.0kb的區(qū)帶出現(xiàn)。在蛋白質(zhì)水平進一步研究發(fā)現(xiàn)50位的精氨酸被甘氨酸取代。

三、診斷分子生物學(xué)在生化遺傳學(xué)實驗室的發(fā)展前景

在我國醫(yī)學(xué)檢驗領(lǐng)域，60年代蛋白質(zhì)研究的興起，70年代酶學(xué)研究的形成，80年代單克隆抗體的開發(fā)為臨床生化檢驗建zxtf.net.cn立靈敏、特異的檢測方法奠定了基礎(chǔ)。許多檢驗指標(biāo)在臨床診斷中起著非常重要的作用。

遺傳性疾病的發(fā)病基礎(chǔ)是核酸分子結(jié)構(gòu)變異與核酸的表達(dá)產(chǎn)物蛋白質(zhì)、酶分子結(jié)構(gòu)改變所致。前者可通過染色體形態(tài)觀察加以分析，后者可通過電泳方法或酶活性測定加以分析。這些方法與免疫方法結(jié)合，使檢測方法特異性更好，靈敏度更高。這些已建立的方法在遺傳性疾病的診斷，蛋白質(zhì)、酶的多態(tài)分析中起重要作用，目前仍為實驗室所廣泛采用。核酸研究的發(fā)展與診斷分子生物學(xué)的形成，使生化遺傳學(xué)研究進入到核酸分子水平，給先天性遺傳病治療帶來了希望。

90年代隨我國對外開放力度不斷加大，對外交流日益加強，診斷分子生物學(xué)在我國形成，發(fā)展異常迅速，不斷地向臨床各學(xué)科各領(lǐng)域滲透。過去認(rèn)為遺傳性疾病無法根治，但基因研究在臨床研究與應(yīng)用的迅速發(fā)展，基因治療的初步形成，已有治療成功的先例�；�因治療的發(fā)展必然給我們基因診斷提出新的課題、新的要求。診斷分子生物學(xué)的發(fā)展速度，基因診斷的水平必將影響基因治療在臨床開展的進程。

近年來，分子生物學(xué)的新技術(shù)、研究成果和學(xué)科生長點頻頻出現(xiàn)，不僅僅在解決人類的疾病診斷、治療方面成績顯著，在解決糧食、環(huán)境等棘手問題也帶來新的希望。分子生物學(xué)研究領(lǐng)域很多，簡而言之主要涉及兩大方面內(nèi)容：基因結(jié)構(gòu)與基因調(diào)控�；�因結(jié)構(gòu)研究就是揭示人基因組的序列分析，該項工作耗資巨大，取得很多成果，但人基因組非常復(fù)雜，有待新的快速測定方法開發(fā)，加快研究速度�；�因調(diào)控研究更為復(fù)雜，參與基因調(diào)控的元件、因子之多，令人眼花繚亂。分子生物學(xué)技術(shù)及研究手段也有多種多樣，但目前在臨床應(yīng)用得較多的主要有雜交技術(shù)和擴增技術(shù)。