臨床生物化學(xué):第四節(jié)　測定酶活性濃度的兩大類方法

一、固定時間法（取樣法)

前面已經(jīng)提到，早期臨床實驗室測酶活性時常使用比色法，先讓酶與底物在一定溫度下作用一段固定的時間，然后停止酶反應(yīng)，加入試劑進(jìn)行化學(xué)反應(yīng)呈色測出底物和產(chǎn)物的變化。由于比色法靈敏度較低，或由于手工操作不易控制好，常定在30分鐘左右。歷史上這類方法常被命名為“終點法”、“二點法”、“固定時間法”和“取樣法”。大多數(shù)文獻(xiàn)使用“固定時間法”。此命名指出了用這類方法測酶活性濃度，必須保證酶和底物在所選定的溫度下作用時間要很精確，否則將引起較大誤差。但“取樣法”的命名更具有特征性。因它指出此類方法和下面將提到的另一類連續(xù)監(jiān)測法相比較，最基本一點的是此類方法停止反應(yīng)后才測底物或物的變化。很難進(jìn)行連續(xù)監(jiān)測，而另一類方法則不需停止酶反應(yīng)，就可測定反應(yīng)物的變化，很容易觀察到反應(yīng)的整個過程。后一類方法開始于50年代，Warburg首先用分光光度計。在340nm處直接監(jiān)測到反應(yīng)物NADH的動態(tài)變化過程。由于不停止酶反應(yīng)，不需添加其它呈色試劑。測定方法簡單，結(jié)果準(zhǔn)確，逐步取代了“取樣法”成為目前測酶活性的主要方法。

由于經(jīng)歷了一個發(fā)展過程，命名比較混亂而且大部分不甚確切，IFCC建議命名為“連續(xù)監(jiān)測法”，不用目前廣為流行的“動態(tài)法”術(shù)語。其原因是目前測酶活性濃度方法都是基于化學(xué)反應(yīng)。圖17-6是一個典型的化學(xué)反應(yīng)過程。

圖17-6　動態(tài)和平衡概念的示意圖

可以看出整個反應(yīng)過程，可以大致分為二個時期。一開始為動態(tài)期，化學(xué)反應(yīng)按一定速度進(jìn)行，反應(yīng)物濃度隨時間而變化，且變化程度不斷變小，到一定時間�；瘜W(xué)反應(yīng)或者達(dá)到平衡，或者反應(yīng)達(dá)到終點，此時反應(yīng)速度為零，反應(yīng)物濃度不變。最近IFCC文件按所用方法所測定的反應(yīng)是在達(dá)到平衡前還是平衡后。分別命名為動態(tài)法或平衡法。一般文獻(xiàn)往往將后一類方法稱為終點法。

二、連續(xù)監(jiān)測法與反應(yīng)進(jìn)程的分析

從這個權(quán)威性的方法分類來看，前面所提到的二類測酶活性濃度方法都應(yīng)歸納為動態(tài)法。目前廣為流行的“動態(tài)法”命名顯然是不確切的或者是不合適的。應(yīng)該更多采用IFCC文件中建議的“連續(xù)監(jiān)測法”命名。

從酶反應(yīng)曲線來比較此二類方法。圖17-7是一個典型酶反應(yīng)過程。

圖17-7　酶促反應(yīng)中基質(zhì)[S]、產(chǎn)物[P]

和反應(yīng)速率V在不同時間變化的模式圖

在酶作用下，底物[S]濃度不斷下降，隨之有相應(yīng)產(chǎn)物[P]產(chǎn)生。不少酶在反應(yīng)一開始的階段，由于各種因素影響，反應(yīng)速度較慢，稱為延滯期，隨后在過量濃度的底物存在條件下，酶反應(yīng)以恒定的速度進(jìn)行，不受底物濃度變化的影響，這段反應(yīng)稱為線性反應(yīng)期或零級反應(yīng)期。隨時間延長，反應(yīng)速度除與酶量有關(guān)，還與底物濃度有關(guān)。即v＝k(a－x)，式中a為原來底物濃度，x為消耗的底物濃度，如反應(yīng)物濃度項上指數(shù)為1，稱為一級反應(yīng)，假如反應(yīng)速率受二種或二種以上物質(zhì)濃度的影響，則各個反應(yīng)物濃度項上指數(shù)總和作為反應(yīng)級數(shù)，可以分別為一級、二級或多級反應(yīng)，總的將這段反應(yīng)時期稱為非線性反應(yīng)期。

很明顯如測反應(yīng)速度的目的是為了從此推算出酶含量的多少，則只有測線性反應(yīng)期的反應(yīng)速度才能作到此點。在延滯期、非線性期測的結(jié)果不準(zhǔn)確，一般是偏低的。

取樣法由于方法學(xué)上的限制，一般只測二管：一為沒發(fā)生酶反應(yīng)的對照管，另一管測酶作用一段時間后反應(yīng)物的變化，實際上測得是平均速度，而且二管間隔時間都較長，在半小時左右，圖17-8中t₀，t分別代表不同時間二管反應(yīng)物的量，雖然從t到t₀反應(yīng)物變化量是相同的。但實際反應(yīng)過程是多種多樣的。

只有當(dāng)反應(yīng)如曲線A時，用“固定時間法”才能測出真實的酶活性，實際工作中是很少見的，圖中曲線B代表了最常見的反應(yīng)情況，在一個很短的線性反應(yīng)期后在大部分測定期間內(nèi)主要為非線性反應(yīng)期。曲線C說明在測定期間包括了延滯期，曲線D則不僅包括了延滯期，還包括非線性期，在這些反應(yīng)中如用固定時間法來測定，結(jié)果是不夠準(zhǔn)確的，一般是偏低的，而且酶濃度愈高，偏離程度愈大。

假如從上節(jié)敘述中得出一個重要結(jié)論：即在設(shè)計和選擇測定酶活性濃度方法時必須是在“最適條件”下測定最大反應(yīng)速度。那么從這段敘述中可得出一個對上述結(jié)論一個很重要的補充，即所測的最大反應(yīng)速度還應(yīng)該是初速度即V₀。

理論上的V₀在實際工作中是不存在的，必須讓酶和底物作用一段時間，消耗掉一定量的底物，才能測出反應(yīng)速度，一般說，如消耗底物在5％內(nèi)所測到的反應(yīng)速度都可認(rèn)為是初速度，如底物濃度很高時，底物消耗在20％以內(nèi)的反應(yīng)往往還在線性反應(yīng)期。

連續(xù)監(jiān)測法能滿足上述重要要求。由于不需停止酶反應(yīng)。很容易得到整個酶反應(yīng)曲線，然后根據(jù)反應(yīng)曲線情況，避開延滯期和非線性反應(yīng)期，zxtf.net.cn/shouyi/只在線性反應(yīng)期測定最大反應(yīng)初速度。同時由于分光光度法的高靈敏度，自動生化分析儀的高精密度，連續(xù)監(jiān)測法能在很短時間，甚至在1分鐘反應(yīng)時間，準(zhǔn)確測定反應(yīng)速度，從而求出準(zhǔn)確的酶活性濃度。“固定時間法”測定時間長達(dá)30分鐘，很難滿足上述方法學(xué)上測定初速度V₀的要求。

圖17-8　二點測定法中可能引起的誤差

從理論上說，只有當(dāng)測定的是初速度，米氏方程式才能成立，并可能測出真正的Km。用“固定時間法”測出的速度受到逆反應(yīng)速度的影響。可以下式表示有逆向反應(yīng)存在時的酶反應(yīng)過程。

k1　k₂　k₃

E＋S→ES→EP→E＋P

←　←　←

K_－1　k_－2　k_－3

存在著EP和P時，就會出現(xiàn)逆反應(yīng)，此時所測的為一表觀速度（Va)或反應(yīng)的凈速度。

Va＝k₂[ES]－k_－2[EP]

[E]t代表酶總量，在反應(yīng)過程中包含了游離酶[E]、酶底物復(fù)合物[ES]和酶產(chǎn)物復(fù)合物[]EP]。

Ks為[ES]的解離常數(shù)，Kp為[EP]的解離常數(shù)，故：

代入上式得：

根據(jù)Maldanc公式Keq＝VfKp/VrKs得：

在反應(yīng)特定時間，產(chǎn)物[P]為一定值，上式得：

此公式從理論上說明，如所測反應(yīng)有逆反應(yīng)存在時，不存在原來的米-門方程式。用各種作圖法很難求出準(zhǔn)確的米氏常數(shù)。如果說所測酶反應(yīng)不僅存在著逆反應(yīng)，產(chǎn)物還抑制了酶反應(yīng)，則動力學(xué)公式將更為復(fù)雜。這就是為什么不僅在建立方法時，就是在研究酶的動力學(xué)時，也總是希望所測量的都是酶反應(yīng)的初速度。

以上這二類方法并不是概括了所有測酶活性濃度的方法，也并不排除在非線性反應(yīng)期測酶活性濃度的可能性。如固定底物變化量，則不同標(biāo)本達(dá)到此變化終點的時間，與酶量成反比例，Somogyi曾提出一種測淀粉酶的方法，酶與底物混合后。每隔半分鐘取一滴出來加入碘液呈色，觀察顏色由紫色變?yōu)榧t色時間，也就是淀粉酶全部水介變?yōu)楹�精的時間，并由此時間的長短計算出酶含量高低，這類方法不需使用很高濃度的底物，有其獨特之外，在自動生化分析儀中也曾使用類似的方法，值得人們重視。

三、連續(xù)監(jiān)測法測酶活性濃度

連續(xù)監(jiān)測法具有眾多的優(yōu)點，隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，自動生化儀的使用，正在逐步取代“固定時間法”，發(fā)達(dá)國家從50年代到70年代末用了約20余年的時間，我國從80年代初開始使用連續(xù)監(jiān)測法，雖然發(fā)展很快，但至少仍有不少地區(qū)醫(yī)院實驗室仍使用老的方法，就是已使用新法的實驗室，也不一定掌握得很好，本節(jié)將比較詳細(xì)地從分類，酶偶聯(lián)反應(yīng)，測定注意事項等方面對連續(xù)監(jiān)測法加以介紹。

（一)連續(xù)監(jiān)測法種類

⒈直接連續(xù)監(jiān)測法這類方法是使用各種分析手段，如分光亮度法、熒光法、pH計、旋光計、電導(dǎo)儀等等，在不停止酶反應(yīng)條件下直接測反應(yīng)體系中底物或產(chǎn)物的變化，從而計算出酶活性濃度，其中尤以分光光度法應(yīng)用最多，應(yīng)用最廣的有NAD(P)H反應(yīng)系統(tǒng)，可以測定大部分的脫氫酶，還有的是所謂“色素原”底物，其本身為無色或微黃色，在酶作用下生成有色化合物，適用于測定水解酶和一些轉(zhuǎn)移酶。

⒉間接連續(xù)監(jiān)測法直接法試劑簡單，操作方便，可惜的是只有當(dāng)?shù)孜锱c產(chǎn)物之間，在光學(xué)性質(zhì)或其它理化性質(zhì)有顯著差異時，才有可能使用此法。到目前為止，大部分酶都無法用直接法測定。

科學(xué)家還曾設(shè)法在原來反應(yīng)體系中添加一些試劑，這些試劑必須不與酶作用也不影響酶活性，同時又能與酶反應(yīng)物迅速作用，產(chǎn)生可以被直接測定的物質(zhì)，典型的例子是Ellman的膽堿酯酶測定法，底物為硫代乙酰膽堿，酶水解產(chǎn)物硫代膽堿與添加的二硫代硝基苯甲酸（DTNB)作用立刻生成黃色化合物，可在412nm用分光光度法連續(xù)監(jiān)測。

實際工作中，更多的是在反應(yīng)體系中加入另一酶試劑。進(jìn)行適當(dāng)?shù)拿复俜磻?yīng)，完全可以勝任上述工作。目前酶偶聯(lián)法已經(jīng)成為應(yīng)用最廣、最頻繁測酶活性濃度的方法。

最簡單的酶偶聯(lián)反應(yīng)為以下模式：

Ex為所要測定的酶，A、B二物質(zhì)分別為其底物和產(chǎn)物，對此二物質(zhì)變化，無法直接監(jiān)測，此時可加入其它酶，其底物為Ex的產(chǎn)物B，其反應(yīng)產(chǎn)物C可直接監(jiān)測，這樣通過第二個酶反應(yīng)有可能推測出第一個酶的活性濃度，外加的第二個酶稱之為指示酶Ei。

如果一些酶反應(yīng)找不到合適的指示酶與其直接偶聯(lián)，此時往往可以加入另一種酶，將二者連接起來，模式如下：

將這種聯(lián)接的酶稱之為輔助酶（Ea)。個別情況可能使用二種乃至二種以上的輔助酶。

酶偶聯(lián)反應(yīng)與一般酶反應(yīng)的一個重要區(qū)別處在于其有一個明顯的延滯期。酶偶聯(lián)反應(yīng)一開始只存在著底物A，不存在指示酶的反應(yīng)，隨著產(chǎn)物B的出現(xiàn)和增加，指示酶反應(yīng)隨之加快，Ex和Ei反應(yīng)速度相等，也就是達(dá)到穩(wěn)態(tài)。從酶反應(yīng)開始至穩(wěn)態(tài)期間，指示酶反應(yīng)較慢且不穩(wěn)定，稱為延滯期。顯然這期間指示酶反應(yīng)速度不能代表測定酶量多少。設(shè)計或選擇酶測定方法時，如果用酶偶聯(lián)法，延滯期越短越好，測定時間一定要避開此期。

是不是所有類型的酶偶聯(lián)反應(yīng)都可用來測酶活性濃度？回答是否定的。因為測酶的活性濃度是依據(jù)測定酶反應(yīng)速度——△A/△t或△B/△t求出。在酶偶聯(lián)法，此值無法直接求出，而是通過測定指示酶反應(yīng)△C/△t間接求出，要使酶偶聯(lián)法測得的酶活性濃度準(zhǔn)確可靠，則Vind＝Vx。換言之，指示酶的最大反應(yīng)速度必須等于或接近測定酶的最大反應(yīng)速度。

當(dāng)測定酶的反應(yīng)速度明顯大于指示酶，此時A很快轉(zhuǎn)變?yōu)锽，由于指示酶反應(yīng)慢，中間產(chǎn)物B大量推積，最終產(chǎn)物產(chǎn)生速度明顯慢于底物A的消失速度。

當(dāng)指示酶速度加大后，中間產(chǎn)物B堆積減小，指示酶反應(yīng)速率偏差程度也變小。只有當(dāng)指示酶大量存在時，出現(xiàn)產(chǎn)物B就能將其迅速變?yōu)镃。

可以看出在延滯期后（即B達(dá)到高峰后的時期)，C和A的變化速度非常一致。也就是只有在些情況下，才是測定酶濃度的理想條件。

從理論上說，用酶偶聯(lián)反應(yīng)測酶活性濃度時，最好條件應(yīng)是測定酶反應(yīng)為限速反應(yīng)。動力學(xué)上為零級反應(yīng)，而指示酶為一級反應(yīng)，酶反應(yīng)速度與指示酶底物濃度相關(guān)。

（二)指示酶、輔助酶的種類和濃度

指示酶、輔助酶的種類：常規(guī)化驗中常用的酶偶聯(lián)法中，多以脫氫酶為指示酶，在常規(guī)化驗中的自動分析儀幾乎無一例外都有340nm波長，通過NAD(P)H系統(tǒng)可以很方便地監(jiān)測到指示酶反應(yīng)。但從理論上說，往往可以有不止一種偶聯(lián)方法，只要設(shè)法使偶聯(lián)反應(yīng)中最后一個是指示酶反應(yīng)，前面已提到測CK可以正向逆向二個方向建立二種不同酶偶聯(lián)的反應(yīng)。又如在丙氨酸轉(zhuǎn)氨基酶（ALT)測定法中，正向反應(yīng)后產(chǎn)生丙酮酸和谷氨酶，目前最常用的是用乳酸脫氫酶與丙酮酸偶聯(lián)反應(yīng)，伴有NADH下降。但也可以用谷氨酸脫氫酶與谷氨酸作用，伴有NADH生成。

總之，酶偶聯(lián)法為實驗室工作者開辟了一個廣闊前景。在設(shè)計和選擇測定酶活性濃度方法時，應(yīng)該創(chuàng)造更新的方法，而不應(yīng)拘泥于書本上的方法。

在選擇時首先應(yīng)考慮方法的特異性。在ALT方法，測定丙酮酸顯然優(yōu)于測谷氨酸，因為多種氨基轉(zhuǎn)移酶都能產(chǎn)生谷氨酸，而只有ALT產(chǎn)生丙酮酸。還有干擾反應(yīng)或副反應(yīng)，在ALT測定中，由于正常以及病理血清中含有一定量丙酮酸，將受到它的干擾，又由于底物中含有大量α-酮戊二酸，可被血中谷氨酸脫氫酶作用消耗NADH。

其次應(yīng)考慮酶偶聯(lián)反應(yīng)的合理性，如能直接與指示酶偶聯(lián)，就沒有必要加入輔助酶，所選用的指示酶、輔助酶除了應(yīng)選Km小的酶（這樣容易使它們催化反應(yīng)速度大大超過測定酶反應(yīng)速度)，還必須考慮指示酶、輔助酶是在測定酶的“最適條件”下工作，此時往往不是指示酶、輔助酶的最適條件，如二者差異太大不利于整個酶系統(tǒng)的反應(yīng)，例如乳酸脫氫酶最適pH為7.4，而丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶最適pH也是7.4，乳酸脫氫酶作為指示酶比谷氨酸脫氫酶更為合適，因后者最適pH為8.4。

如最后制成試劑盒，則還需從經(jīng)濟(jì)角度選擇一些價廉物美，又易取材、純化得到的酶制劑。

（三)指示酶、輔助酶的濃度

從上節(jié)描述中可以知道建立一個合適的酶偶聯(lián)反應(yīng)體系，不是很容易的指示酶，輔助酶的反應(yīng)要能準(zhǔn)確反映出測定酶含量，中間產(chǎn)物必須低，延滯期必須短，要作到此點，這些工具酶用量很大，但用量過大經(jīng)濟(jì)上不合算，所以在酶偶聯(lián)測定法中，選用適當(dāng)量的指示酶是一個重要的問題。一般可用反復(fù)試驗法，即試驗性地選用不同量的指示酸直到偶聯(lián)酶反應(yīng)中指示酶反應(yīng)速度不隨工具酶的增加而升高，并在所選用的“最適條件”下，指示酶反應(yīng)速度和酶活性濃度成正比例。

這種方法工作量大，而且不一定能得到最適結(jié)果，較好的辦法是可先從理論上進(jìn)行計算，得出一個大約結(jié)果，然后在此范圍內(nèi)進(jìn)行試驗，這樣可以節(jié)約時間和精力。

最簡單的方法是根據(jù)Vx/(Km)x＝Vi/(Km)i的比值來選擇指示酶的用量Vi，式中Vx為測定酶的測定上限，(Km)x和(Km)i分別是測定酶和指示酶的米氏常數(shù)；有人計算過當(dāng)比值為1:100時，測定值低4％；如改為1:10時，指示酶的反應(yīng)速度將比測定酶反應(yīng)速度慢28％，如增加到1:1000，則誤差只有0.7％。

這是因為，當(dāng)我們用酶偶聯(lián)反應(yīng)體系測酶活性濃度時，測定酶的反應(yīng)必須是體系中的限速反應(yīng)，工具酶所催化的最大反應(yīng)速度必須遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于測定酶，由于工具酶所催化的反應(yīng)必須在中間產(chǎn)物濃度很低條件下進(jìn)行，并且將其很快轉(zhuǎn)變?yōu)樽罱K產(chǎn)物，反應(yīng)體系中不應(yīng)有中間產(chǎn)物堆積，否則將導(dǎo)致誤差。

下面舉一實例，在肌酸激酶測定法中，CK的Km為2.4mmol/L，指示酶6-磷酸葡萄糖脫氫酶的Km為0.27mmol/L，如我們將CK測定上限定為450μ/L（實際測定時標(biāo)本稀釋60倍，實際為7.5μ/L)，如希望上述比例為1:100。代入上式：

Vi＝3.1×10^－3×min^－1×0.27mmol×1

＝0.835×10^－3×mmol×min^－1

＝0.835U

如反應(yīng)體系為1ml，求出在此反應(yīng)體系中只需0.835U的6-磷酸葡萄糖脫氫酶即可。

另一法可以根據(jù)米氏方程式來計算，在酶偶聯(lián)反應(yīng)中，指示酶催化速度（Vi)的米氏方程式為：

以天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST)為例希望中間產(chǎn)物P濃度很低，定為0.001mmol/L，指示酶蘋果酸脫氫酶。Km為0.0165mmol/L，如設(shè)定AST上限為300U/L（標(biāo)本為1:12稀釋，實測上限為25U/L)。代入上式：

Vi＝0.0014mmol min^－1＝1.4U

得1.4U，如反應(yīng)體系為3ml，則試劑中蘋果酸脫氫酶用量為466U/L，目前試劑中用量為600U/L。從以上計算來看，試劑中用量是足夠的。

在酶偶聯(lián)反應(yīng)體系中，不可避免會出現(xiàn)延滯期，在測定酶時希望此延滯期愈短愈好，此時可利用Mcclure介紹的計算法計算出一定延滯期時所需指示酶的量。

Mcclure假定在下面酶偶聯(lián)反應(yīng)中：

第一個反應(yīng)為零級反應(yīng)，第二個反應(yīng)為一級反應(yīng)，且中間產(chǎn)物B濃度遠(yuǎn)小于指示酶的Km，即B<<(Km)i。

通過推導(dǎo)，可得

dB/dt＝k₁－k₂B

上式積分得：

當(dāng)t足夠大時，e-k₂t→0，此時B濃度不變達(dá)到穩(wěn)態(tài)，此時B的濃度為Bss，代入上式：

首先可得　Bss＝k₁/k₂

以及l(fā)n[1－B/Bss] ＝－k₂t

同時在穩(wěn)態(tài)下，k₂是指示酶正向反應(yīng)的常數(shù)，在一級反應(yīng)中k₂＝Vi/(Km)i。

令F＝B/Bss，此即在時間t時產(chǎn)物B為其穩(wěn)態(tài)濃度的百分?jǐn)?shù)，一般選用0.99。

最后可得公式：

Vi＝

例如在CK測定中，指示酶6-磷酸葡萄糖脫氫酶Km為0.11mmol/L，我們希望延滯時間為1分鐘，則指示酶用量為：

總之，從上式可清楚看到，延滯時間t與指示酶的Km成正比例，用量成反比。

四、酶活性的濃度單位

50年代以前酶活性濃度單位的命名混亂，常以方法提出者的姓氏來命名，例如淀粉酶的Somogyi單位，堿性磷酸酶的King單位等等，定義參差不齊，給臨床醫(yī)師帶來很大不便，尤其在建立“連續(xù)監(jiān)測法”測酶后，大量酶應(yīng)用于臨床，此混亂現(xiàn)象更為突出。1963年國際生化協(xié)會通過廣泛討論，提出一個國際單位定義來表示酶量的多少，即1分鐘能轉(zhuǎn)化1微摩爾底物（μmolmin^－1)的酶量為一個國際單位，以IU表示之，由于意見不一致，至今尚未指定酶反應(yīng)溫度，而同一量的酶，在不同溫度時間為1分鐘所轉(zhuǎn)化底物的量將有明顯差異。為避免臨床上誤認(rèn)為只要是同一國際單位的酶量在國際上無論何處所測結(jié)果都應(yīng)一致，目前大多數(shù)實驗工作者常省略國際二字（簡寫也由IU改為U)。

臨床上測定的不是酶的絕對量而是濃度，1963年并未明確規(guī)定用ml或L表示體積。舊的文獻(xiàn)中可見到mU/ml，或U/L。目前在臨床化學(xué)中，幾乎都習(xí)慣用U/L來表示體液中酶活性濃度。我國由于近年來大量用自動分析儀和連續(xù)監(jiān)測法測酶，已逐步不再使用各種古老單位，而使用U/L來表示酶活性濃度。

近年來國際上大力推廣SI制，我國已明確SI制為法定計量單位制，SI制中酶活性單位為Katal，即1秒中轉(zhuǎn)化1個摩爾底物（mol s^－1)的酶量，Katal對體液中酶量而言顯然過大，常用單位為ukatal或nkatal。

上述國際單位和katal間關(guān)系如下：

1U＝1μmol min^－1＝16.67nmol s^－1＝16.67nkatal

在我國不論實驗室還是臨床醫(yī)師對katal都不太熟悉，如報告使用katal/L報告酶結(jié)果時，最好同時注明相應(yīng)的U/L。

（一)連續(xù)監(jiān)測法中酶活性濃度的計算

前面已提到連續(xù)監(jiān)測法優(yōu)點之一是計算方便，不需作標(biāo)準(zhǔn)曲線或標(biāo)準(zhǔn)管，用分光光度計監(jiān)測酶反應(yīng)過程時，很容易求出反應(yīng)體系每分鐘吸光度變化，根據(jù)摩爾吸光系數(shù)可求出△A相當(dāng)測定物質(zhì)變化的微摩爾數(shù)，由于臨床醫(yī)師需要知道的是標(biāo)本中而不是反應(yīng)體系中酶的濃度，計算中要考慮標(biāo)本的稀釋倍數(shù)，假如比色杯光徑不是1cm，則還應(yīng)考慮光徑不同對△A的影響，這樣整個計算公式應(yīng)為：

此中ε為摩爾（線性)吸光體系（mol^－1·L·cm^－1)

△A為吸光度變化

v為標(biāo)本體積（ml)

V為反應(yīng)體系體積（ml)

L為光徑（cm)

在實際測定中后面幾項皆為常數(shù)，所以上式常簡化為：

（二)常數(shù)K的意義和設(shè)置

在測酶時，常數(shù)K值的選擇是很重要的。此值過高雖然測定的線性范圍較寬，但重復(fù)性差，反之，雖然精密度好，但線性窄。

此問題與儀器測定的嗓音（noise)密切相關(guān)，自動分析儀吸光度讀數(shù)嗓音一般都需控制在0.001，也就是儀器須保證對同一溶液反復(fù)進(jìn)行測定時，吸光度誤差最好控制0.001上下，雖然此值不大，但已可能使測定結(jié)果產(chǎn)生1/1000K值的誤差，如K值為6000，代入上式，則每分鐘測定吸光度如有0.001微小變化，結(jié)果將是出現(xiàn)上下6U/L的誤差，對于一此參考值較低的酶，如轉(zhuǎn)氨酶而言顯然太大，臨床醫(yī)師無法容忍這么大差異。

K值設(shè)置的首先出發(fā)點應(yīng)是測定酶的判斷值或參考值上限，應(yīng)保證這些值測定的可靠，所以轉(zhuǎn)氨酶的常數(shù)K一般在3000左右，不少人寧愿在1500左右，另外還應(yīng)考慮到測定時間，一些半自動分析儀測定時間短到0.5分，此時0.001嗓音對每分鐘△A誤差將是0.002，反之，測定時間延長到2分鐘，誤差也小一半，也就是說，如測定時間長，則K值可以設(shè)置大一些，如測定時間只有0.5分鐘，K值一般不超過4000。

改變K值最方便的途徑就是改變標(biāo)本稀釋度，稀釋倍數(shù)愈大，K值愈大。

（三)常數(shù)K值的檢驗

摩爾吸光系數(shù)（ε)對一定物質(zhì)而言常是一個定值，但在一些外界條件影響下也會有所變化。最明顯例子是對硝基酚，隨pH不同，顏色差異明顯，當(dāng)pH＞10時，405nm處其ε為18500，在pH7.0，ε下降為9400，顏色下降幾乎一半。溫度變化時，也會對NAD(P)H的ε產(chǎn)生一些影響。當(dāng)波長大于334nm時，隨溫度升高，同一波長的ε值會輕度下降。

同時ε值是指用分光光度法，也就是在近似單色光的光源條件下才能成立，實際上大多數(shù)自動分析儀使用的是干涉濾片，波峰值可能出現(xiàn)差異，個別的半波寬可能為10nm乃至更大。由于雜散光的存在，會明顯改變ε值，假如再考慮到注加系統(tǒng)的誤差，實測K值很可能與理論K值不一致。Onuki檢測了三臺Hitachi-7150型自動分析儀測AST的K值分別為－5466、－5421、－5559。而理論K值為－6111則結(jié)果約增加為1.12倍。

測定實際的K值不是一件困難的事，目前有些自動分析儀已有相應(yīng)的軟件和試劑可以進(jìn)行檢測。事實上對一些性質(zhì)穩(wěn)定的物質(zhì)如對硝基酚、對硝基苯胺，可以用高純試劑配成標(biāo)準(zhǔn)品或直接購買可靠的校準(zhǔn)品，將它們作為標(biāo)本進(jìn)行酶的測定，根據(jù)已知標(biāo)準(zhǔn)品的濃度和吸光度變化就可計算出實際K值，但此法不適用于測與NAD(P)H反應(yīng)有關(guān)酶測定的K值。因為NAD(P)H不穩(wěn)定，此時可使用測葡萄糖的紫外分光光度法試劑盒，對已知濃度的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行終點法測定，此法產(chǎn)生與葡萄糖相等摩爾數(shù)的NAD(P)H，故不難從吸光度變化求出K值，也有人用乳酸脫氫酶測已知量的丙酮酸來求K值。

五、連續(xù)監(jiān)測法中的干擾因素及其控制

大多數(shù)測定標(biāo)本不是純酶制劑，而是體液或組織液。其中除了測定酶外，還存在著其它酶和各種物質(zhì)，如使用酶偶聯(lián)反應(yīng)，在反應(yīng)體系中又外添了大量的各種酶制劑，因此在反應(yīng)體系中可能出現(xiàn)一些我們不希望的副反應(yīng)或旁路反應(yīng)，這些都有可能對測定反應(yīng)產(chǎn)生干擾。

（一)其它酶和物質(zhì)的干擾

如組織勻漿中往往含有NADH-細(xì)胞色素C還原酶，它將干擾各種還原酶的測定。臨床酶測定中最典型的例子是血液中丙酮酸對丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶測定的干擾，由于反應(yīng)體系中含有大量乳酸脫氫酶和NADH，可與丙酮酸反應(yīng)消耗NADH，引起340nm處吸亮度下降，假如將此NADH下降也算為ALT活性將引起誤差。其www.med126.com它如紅細(xì)胞中腺苷酸激酶（AK)對CK測定的干擾，在CK的酶偶聯(lián)體系中ADP是CK底物，但它又同時是AK的底物，二個酶反應(yīng)都產(chǎn)生ATP，在工具酶（已糖激酶和6-磷酸葡萄糖脫氫酶)作用下都產(chǎn)生NADH引起340nm處吸光度上升，其結(jié)果是CK測定結(jié)果偏高，為避免此種干擾，所以在反應(yīng)體系中加入AK的抑制劑AMP和二腺苷酸5′磷酸。

（二)工具酶的污染

目前試劑中所用的試劑酶多從動物組織或細(xì)菌中提取，不可避免地會污染有其它酶，如不注意此問題，會引起不正確結(jié)果，例如丙酮酸羧化酶催化下列反應(yīng)：

可加入蘋果酸脫氫酶和NADH進(jìn)行測定，將草酰乙酸轉(zhuǎn)變?yōu)樘O果酸，并將NADH轉(zhuǎn)變?yōu)镹AP⁺。如果工具酶蘋果酸脫氫酶不純，含有乳酸脫氫酶，也可以作用底物之一的丙酮酸，同時消耗NADH，這樣就無法準(zhǔn)確測定丙酮酸羧化酶活性。

更有甚者，有些工具酶中就混有測定酶，這種情況下，將產(chǎn)生很高的本底。

所以所用的工具酶必須很純，并檢查污染酶的含量，例如測定天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶所用的蘋果酸脫氫酶中所含雜的AST時，按IFCC規(guī)定不應(yīng)超過0.005％。

（三)非酶反應(yīng)

有些底物不穩(wěn)定，沒有酶的作用就能自行反應(yīng)，例如ALP的底物磷酸對硝基酚配成的底物溶液，室溫放置過夜，即自行水解釋放出對硝基成黃色。又如測醛縮酶時，其底物醛類化合物可以和NAD⁺起非酶反應(yīng)產(chǎn)生一種具有類似NADH吸收光譜的化合物，給測定帶來困難。

（四)分析容器的污染

如沖洗不當(dāng)，分析容器和管道中混雜有各種物質(zhì)，可能影響酶活性，如微量重金屬可使酶失活，殘留的表面活性劑可能抑制酶活性。

（五)沉淀形成

使用光學(xué)法監(jiān)測酶反應(yīng)時，如有沉淀形成或組織勻漿中顆粒的下沉都會引起吸光度變化，引起測定結(jié)果誤差，此情況常見于底物溶解度低而反應(yīng)體系中底物濃度偏高�？梢娪谟忙�-谷氨酰對硝基苯胺為底物測GGT時。

對上述的一些問題�？赏ㄟ^試劑空白管檢出并加以校正。不同廠家的ALT，AST試劑盒由于雜酶存在，試劑空白管可以測出多少不等轉(zhuǎn)氨酶活性，個別可達(dá)5U/L以上，這種試劑無法使用，較好的試劑盒也在2U/L左右。如不作試劑空白管對結(jié)果加以校正，所測結(jié)果將偏高，用半自動分析儀測定酶時特別要注意作試劑空白管，有時還需作標(biāo)本對照管，例如測ALT時為除去GLD的干擾，可以在底物溶液中不加入丙氨酸，與標(biāo)本中GLD作用引起NADH下降。

解決這些問題另一個有效措施就是不用單一試劑測酶活性，改用雙試劑，先加的第一試劑常不含底物或底物之一，但含有所有其它成分，與標(biāo)本作用一段時間待吸光度停止變化后，再加入底物開始測定酶的反應(yīng)。