臨床生物化學(xué):第三節(jié)　臨床生化自動分析的方法

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自動分析儀的應(yīng)用決不僅僅是操作方法的變化，由于引進了一系列高精技術(shù)，所用的方法測定原理都有了迅速的發(fā)展。因此，用好自動分析儀的一個重要前提，必須對自動分析儀可以提供的測試方法類型、主要實驗室參數(shù)和儀器室條件及儀器操作有所了解。一、分析方法的分類臨床生…

自動分析儀的應(yīng)用決不僅僅是操作方法的變化，由于引進了一系列高精技術(shù)，所用的方法測定原理都有了迅速的發(fā)展。因此，用好自動分析儀的一個重要前提，必須對自動分析儀可以提供的測試方法類型、主要實驗室參數(shù)和儀器室條件及儀器操作有所了解。

一、分析方法的分類

臨床生化常用方法根據(jù)其測定的原理可作如圖19-5法分類。一類方法是物理方法，測定是物質(zhì)固有的物理特性。另一類是物理化學(xué)方法，也就是將所測定物質(zhì)進行一些化學(xué)轉(zhuǎn)化后再進行測定。動態(tài)法是在所測定的物質(zhì)濃度在不斷變化中，由傳感器獲得相應(yīng)的改變的信號進行計算的方法。平衡法是由傳感器得到相對不變的信號進行計算的方法�，F(xiàn)在越來越多被臨床生化應(yīng)用的酶試劑方法，無論是用自動分析儀記錄或分光亮度計或普通比色計都包括在動態(tài)法的范圍內(nèi)。

（一)平衡法（終點法)

這類方法的特點是被測物質(zhì)（酶反應(yīng)的底物)在酶反應(yīng)過程中應(yīng)完全被轉(zhuǎn)化或消耗掉，即達到反應(yīng)的終點。通常這類方法操作簡單，一般不需要作標準管，通過一些已知的理化常數(shù)，例如克分子吸光系數(shù)等不難將結(jié)果計算出來。其缺點是反應(yīng)時間較長，特別不適合于離心式自動分析儀。還有少數(shù)酶反應(yīng)，底物并未完全消耗掉，只是達到一個動態(tài)平衡，此時，往往需要同時作標準管。

圖19-5　臨床生化方法的分類

⒈一步法試劑酶的底物（S)就是所測的物質(zhì)，在試劑酶作用于S后完全轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物（P)，由于S和P具有完全不同的理化性質(zhì)，從而可根據(jù)對S或P的濃度變化進行連續(xù)監(jiān)測。使用最多的還是光度法，尤其是在340nm處測定NAD(P)H的生成或消耗量。在實際應(yīng)用上最多的仍是和NAD(P)H有關(guān)的脫氫反應(yīng)。如用乙醇脫氫酶測乙醇的含量或用乳酸脫氫酶測丙酮酸等。

⒉酶偶聯(lián)反應(yīng)和測定酶活性方法一樣，有時單用一個酶（輔助酶，Ea)不行，因為S和P之間往往無明顯差異，不能直接測定，此時可以加入另外的酶（指示酶，Ei)，將反應(yīng)偶聯(lián)起來，通過測定指示酶反應(yīng)間接推算出所測物質(zhì)，即第一個酶作用底物的濃度。

反應(yīng)通式如下：

若Ei是一個脫氫酶，在反應(yīng)過程中同時伴有NAD(P)H和NAD(P)間的轉(zhuǎn)化，故不難在340nm處進行連續(xù)監(jiān)測。另一常用的酶是過氧化物酶，可以通過新生態(tài)氧和一些色素原作用顯色而進行測定。例如用已糖激酶（HK)法和葡萄糖氧化酶（GOD)法來測定葡萄糖等。

另外，還有一類少用的偶聯(lián)酶反應(yīng)，指示酶反應(yīng)在輔助酶反應(yīng)之前，而不是在后。

式中S₁是欲測物質(zhì)，往往另一底物S₂不穩(wěn)定，通過先行的指示酶產(chǎn)生S₂，如乙酰CoA的測定。

其中草酰乙酸很不穩(wěn)定，可通過蘋果酸脫氫酶作用生成。

從理論上說酶催化反應(yīng)都是可逆的反應(yīng)，除水解酶外，大多數(shù)酶往往都不易將底物完全轉(zhuǎn)換或消耗掉。�？赏ㄟ^增加不需測定的另一底物濃度，改變pH，使用捕獲劑（trap-ping agent)等改變平衡點，使反應(yīng)偏向一側(cè)，達到或接近反應(yīng)完全。

（二)動態(tài)法

動態(tài)法在自動分析儀中的應(yīng)用十分廣泛，但是動態(tài)法的分類一直比較混亂。一般可分為可變信號法和固定信號法兩類。

⒈可變信號法

⑴直接法即根據(jù)所得到的吸光度變化直接計算結(jié)果：由于對所收集數(shù)據(jù)多少有很大意義，所以又區(qū)分為一點法、二點法、多點法。一點法是在一個預(yù)先設(shè)置時間測定各個標本吸光度。二點法則是在一點法基礎(chǔ)上多測一點，即在酶反應(yīng)仍未進行時的吸光度，和一點法相比可以通過空白測定扣除這部分誤差，但是仍無法了解反應(yīng)過程，避免不了延緩期或非線性反應(yīng)所引起的誤差。多點法如使用確當(dāng)，對標本空白和反應(yīng)過程都有詳細了解，可用以下兩法：

一法是求出不同測定點間吸光度的差異即所謂delta法。各點吸光度差異可用б＝△A＝A_n－A_n_－1計算出。根據(jù)這些數(shù)據(jù)可以觀察反應(yīng)是否符合線性，并計算出被測物質(zhì)濃度。偏離線性的數(shù)據(jù)在計算結(jié)果時應(yīng)摒棄。很多早期自動生化儀都使用此法。另一法則是使用回歸法，根據(jù)一定公式如線性公式y(tǒng)＝a＋bx對獲得的多個數(shù)據(jù)進行計算，求出斜率b和截距a。這類方法也可用于濃度計算。和delta方法相比，不僅可適用于線性反應(yīng)，也可適用于其它非線性反應(yīng)。

⑵導(dǎo)數(shù)法在此法中使用電子線路計算出反應(yīng)瞬間的一階和二階導(dǎo)數(shù)：bekman system TR就使用了這樣方法，它可以同時計算出一階和二階導(dǎo)數(shù)，用二階導(dǎo)數(shù)來觀察哪一段反應(yīng)為線性反應(yīng)，并用線性反應(yīng)段上的一階導(dǎo)數(shù)計算出物質(zhì)濃度。此法單用導(dǎo)數(shù)方法并不記錄吸光度變化（△A)，所以此法所提供的信息往往少于回歸法，例如無法觀察到反應(yīng)中底物的消耗情況。

⑶積分法此法原理是運算放大器對反應(yīng)曲線二個節(jié)段的吸光度進行積分。并計算出部分面積之差。Vitatron分析儀用此差值來考慮線性段，但仍用△A法計算結(jié)果。

⒉固定信號法測定原理是隨著反應(yīng)進行，通過不斷添加試劑使吸光度變化在很窄范圍內(nèi)，此時所測的是加試劑的量，并依此來計算物質(zhì)濃度。最典型例子是以對硝基酚作為指示劑的乙酰膽堿酯酶方法，在反應(yīng)過程中不斷加入堿以中和酶水解產(chǎn)物乙酸以維持pH不變，然后根據(jù)所加堿量計算酶含量。這一類方法由于操作費時麻煩，目前應(yīng)用很少，但不應(yīng)忘記這類方法能維持反應(yīng)條件如pH的恒定性，其它如在NADH參與的反應(yīng)中不斷加入NADH有助于避免底物的消耗，在一些特殊情況下可能還是有用的。

由此可見，假如從方便簡單不需復(fù)雜儀器而言，則一點和二點法應(yīng)為首選。而回歸法、積分和導(dǎo)數(shù)法不易進行。如從可靠性來進行比較，則多點回歸法應(yīng)居榜首，一點和二點法最不準確。

回歸法的缺點是此法可以不考慮收集的數(shù)據(jù)是否可靠，不管各數(shù)據(jù)是否偏離曲線或明顯不呈線性，也可求得一個線性方程式。所以，一個好的回歸方程式還應(yīng)給出標準差和有關(guān)參數(shù)，這樣即可用來評價用回歸法所得結(jié)果的可靠性。根據(jù)Pardue意見，使用較多數(shù)據(jù)且設(shè)計良好的回歸方法是首選的。

（三)固定時間法（二點法)

固定時間法在自動分析儀中的應(yīng)用，有助于我們解決反應(yīng)的特異性問題，最明顯的例子就是苦味酸法測肌酐和溴甲酚綠法測白蛋白。人們早就知道很多物質(zhì)如維生素C、乙酰醋酸、葡萄糖、果糖以及某些藥物也能和苦味酸呈色。近年來發(fā)現(xiàn)這些zxtf.net.cn/yaoshi/干擾物質(zhì)呈色較慢，提出用自動生化儀只測定開始一分鐘的反應(yīng)，明顯提高了苦味酸法測肌酐的特異性。用溴甲酚綠測白蛋白法，此法由于簡單易行，在70年代取代了經(jīng)典的鹽析法，但隨即發(fā)現(xiàn)一部分球蛋白如α球蛋白也能和溴甲酚綠結(jié)合，但這類反應(yīng)比較遲，所以目前更多地使用自動分析儀測定開始一分鐘的反應(yīng)來計算白蛋白量。

固定時間法之所以受到愈來愈多注意，更重要因素是酶試劑的應(yīng)用（詳見有關(guān)章節(jié))。

（四)空白對照方法

由于使用了各種高新技術(shù)，在自動生化分析儀中人們可以根據(jù)實際情況，使用各種空白和對照方法。

⒈固定法空白①試劑；②標本＋鹽水；③標本＋空白試劑；④標本＋滅能試劑；⑤標本＋完全試劑（時間不同)；

⒉動態(tài)法空白①試劑空白；②標本＋空白試劑。

從理論上說固定空白法用“標本＋完全試劑”是最好的辦法，此法可以扣除各種因素的誤差，如試劑、比色杯等，這也是在自動生化儀應(yīng)用較多的方法，而用手工法是不易做到的。動態(tài)空白僅用于少數(shù)試劑不穩(wěn)定方法，如以固紅B測天門冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶。

二、主要實驗參數(shù)的選擇（設(shè)置)

一般自動分析儀有12個主要數(shù)據(jù)，即波長、溫度、標本及試劑量、空白時間（Tb)、開始收集實驗數(shù)據(jù)時間（Ti)、實驗數(shù)據(jù)收集窗時間（TW)、實驗數(shù)據(jù)收集完成時間（Td)和最后時間（Tf)、速率時間（Tr)、線性限度（L)、異常吸收率（ABN)、曲線擬合、濃度因素（F)。這些參數(shù)都是通過方法學(xué)的研究之后，根據(jù)反應(yīng)的具體情況加以確定的。

（一)波長

根據(jù)分光亮度計的光吸收曲線或者一個比色杯不同波長的反應(yīng)曲線選擇分析波長和空白波長。對快速反應(yīng)，以光吸收曲線的低凹區(qū)波長為空白波長，光吸收曲線中吸亮度最大而較平坦區(qū)的波長為分析波長。

（二)溫度

一般均選用30℃。

（三)樣品量及試劑量

可根據(jù)手工法按比例縮減或者重新設(shè)計。要考慮到檢測靈敏度、線性范圍，盡可能將樣品稀釋倍數(shù)大些，以降低樣品中其它成分的影響。

（四)分析時間的確定

用高、中、低濃度的標準液進行實驗用研究模式，進行酶促反應(yīng)時間曲線或反應(yīng)速度時間曲線的觀察，根據(jù)吸收率動態(tài)變化的具體數(shù)據(jù)，確定有關(guān)的分析時間。

⒈Tb 終點法，吸光度上升型，一般選擇反應(yīng)尚示開始而試劑和樣品已充分混合均勻，一般定為4秒。動態(tài)法的Tb＝Ti。

⒉Ti 終點法選擇反應(yīng)接近平衡期，動態(tài)法則選擇接近進入線性期。這個參數(shù)不很嚴格。如果Ti定的太早，過多的不符合要求的數(shù)據(jù)點將舍棄。Ti定的太晚，數(shù)據(jù)收集時間就要延長，在動態(tài)法還可能使底物耗盡的發(fā)生機會增多。在終點法Ti大致定于Tf的70％或接近于反應(yīng)完全時，動態(tài)法確定Ti時，主要考慮避開酶反應(yīng)的延遲期以及試劑和樣品混合后溫度不平衡期。

⒊TW 根據(jù)高、中、低濃度標準液反應(yīng)速度時間曲線加以確定。要求各標準液的吸光度變化在該時間內(nèi)均在線性判斷標準范圍內(nèi)。終點法一般為4-10秒。在動態(tài)法中，為了使反應(yīng)不出現(xiàn)未反應(yīng)（NR)的標志，在Tb與Tf之間至少有8mA的吸收率變化。在快速反應(yīng)時，TW從30秒開始，按10秒向上遞增。在慢反應(yīng)可達120秒。TW不應(yīng)太長，否則可以偏離線性，也減低工作效率。

⒋Tr　Tr值的大小對方法的精密度有較顯著的影響。為了保證方法的精密度，使△A＞1.0mA是必要的。如Tr時間短，△A太小，測定方法的精密度就降低。一般情況下，Tr定為20-60秒。在現(xiàn)有程序中，是以正常低值標本的△A＞1mA來決定Tr值。如ALT測定，正常低值為7u/L，Tr＝7u/L/2.57＝2.7mA/60秒，30秒＝1.35mA，故選30秒為Tr時間。

（五)線性判斷標準（線性限L)

指在數(shù)據(jù)收集窗時間內(nèi)吸收率變化的允許范圍。作為終點法，從理論上講，化學(xué)反應(yīng)達到平衡（終點)，吸光度應(yīng)該穩(wěn)定不變，也就是說，在TW內(nèi)吸收率變化應(yīng)該是零，即線性判斷標準應(yīng)該定為零。在實際中，由于信號有一定的飄移，更主要是測定要求快速，是在反應(yīng)還沒真正到達終點時進行測定，加上自動分析儀檢測的靈敏度大多較高，精度可達到0.1mA，所以在TW期間的吸收率會有一定的波動。不同的化學(xué)反應(yīng)或酶促反應(yīng)，吸光度變化程度不一。要根據(jù)實驗結(jié)果選擇一個適當(dāng)?shù)奈舛茸兓秶鳛榫€性判斷標準，以此來判定反應(yīng)是否達到了平衡。這個標準值如果定的太小，反應(yīng)也很難達到要求的標準，出現(xiàn)非線性的機會太多，或者要延長觀測時間，降低工作效率，這就不符合快速分析的要求。相反，這個線性判斷標準定的太大，就失去了判斷線性的意義，出現(xiàn)反應(yīng)根本沒有達到終點就錯誤地判為達到標準，影響測定結(jié)果的可靠性。在終點法中，L單位是mA/2秒，大多選用1.0mA/2秒。如出現(xiàn)反應(yīng)不完全，可按0.5mA順序增加。在動態(tài)法中，L單位是mA/秒，一般從0.1mA/秒開始，如果試驗結(jié)果出現(xiàn)非線性（NL)情況多，可以增大，按0.01mA遞增，但不可超過0.1mA。

（六)異常吸收率限度

這一參數(shù)主要根據(jù)每個方法實驗測定的線性范圍來確定。即用吸光率作為縱軸，標準液濃度為橫軸，繪制標準曲線。這個線性段向非線性段轉(zhuǎn)折拐點的相應(yīng)吸收率值即為異常吸收率限度。終點法吸收率超過此值被標志為超出限度（XL)。在動態(tài)法中，試劑空白的吸收率超過ABN，ABN被標志為試劑吸收率異常（AB)，測定杯的吸收率超過ABN時，ABN被標志為底物耗盡（EX)。