動(dòng)脈粥樣硬化:第二節(jié)　血漿脂蛋白超速離心分離純化法

一、超速離心法簡(jiǎn)介

為了研究，常需要得到脂蛋白純品并進(jìn)一步分離純化載脂蛋白，迄至目前為止，采用密度梯度超速離心分離純化各種脂蛋白仍是一種很好的方法。

超速離心法可分為制備型和分析型兩種，根據(jù)其所用介質(zhì)密度不同，可以分為等密度離心，密度梯度離心等。根據(jù)所用轉(zhuǎn)頭的類型不同可以分為角頭、甩平頭、垂直頭和區(qū)帶頭離心法。脂蛋白分離中，采用密度梯度超速離心法較多。

離心作用是根據(jù)穩(wěn)定角速度下做圓周運(yùn)動(dòng)的任何物質(zhì)都受到一個(gè)外向的離心力F，這種力的大小取決于角速度（以弧度ω表示)和旋轉(zhuǎn)半徑r（以cm計(jì)算)。

F=ω²r

F常用地球引力表示，稱為相對(duì)離心力（RCF)或者常用“數(shù)字×g”來表示。

RCF=ω²r/980

在使用該公式時(shí)，這些關(guān)系需用“每min轉(zhuǎn)數(shù)（r/min)”表示，這是表示離心機(jī)轉(zhuǎn)動(dòng)速度的普通方式。

由于（r/min)的數(shù)值可轉(zhuǎn)換成弧度，利用ω=π（r/min)/30公式代入上式，得到下述換算式：

RCF-（πr/min)²×r/30²/980=（1.119×10^-5)（r/min)²·r

對(duì)于在離心轉(zhuǎn)頭中旋轉(zhuǎn)的樣品，估計(jì)其所受到的相對(duì)離心力需要考慮樣品到旋轉(zhuǎn)中心的固定距離（r)。由于轉(zhuǎn)頭的形狀設(shè)計(jì)，離心管中從管頂主管底各點(diǎn)旋轉(zhuǎn)中心的距離是不同的。例如在固定的角式轉(zhuǎn)頭中，作用于離心管頂部和底部的離心力的差別接近一倍。為了計(jì)算相對(duì)離心力的數(shù)值可用平均相對(duì)離心力（RCF_平均)來表示，即同一離心轉(zhuǎn)頭頂部和底部所受離心力的平均值。因此，最重要的將是確定半徑（r)的數(shù)值。

形成密度梯度操作，可采用兩種方法，一是利用自動(dòng)形成器，此裝置是在一根管道上裝有兩個(gè)容器，各以T型管與此管道相通，兩容器分別裝入輕液和重液，按比例進(jìn)入混合器，并用蠕動(dòng)泵將溶液注入超離心管內(nèi)，形成不同密度液，加入到超離心管中，使其離心管中液體成密度梯度離心分布。二是采用手工操作，先配成不同密度溶液，人工一層層鋪蓋到超離心管內(nèi)，使超離心管中成為不同密度梯度的溶夜。

超速離心后樣品的收集可根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)條件采用下述幾種方法。

（1)切割法：在固定的刀架上，將已離心好的樣品管放在所要求的高度（按管內(nèi)分離區(qū)帶確定)用刀切斷離心管，取出樣品。

（2)虹吸法：用蠕動(dòng)泵或吸管將樣品從上至下逐層按區(qū)帶吸出并分管收集。泵管或吸管注意每區(qū)帶一管，不能混用。

（3)穿剌法：用針頭在超速離心管底部穿一小孔，讓液體從底部流出，并按區(qū)帶分部收集。

分管收集到的各區(qū)帶樣品，可采用折光儀，測(cè)出折光系數(shù)，從表中查出相應(yīng)溶液的水合密度，從而確認(rèn)各組份的分布樣品的水合密度。

二、Hatch-Lee法（同時(shí)分離血漿脂蛋白方法)

1．試劑

0.5mol/LEDTA（pH8.0zxtf.net.cn/wszg/):186g EDTA-Na₂加入去離水950ml，用NaOH調(diào)準(zhǔn)pH值，再加水到1L。

溶液①（d=1.006):NaCl 11.40g,0.5ml0.5mol/L EDTA液，加去離子zxtf.net.cn/zhuyuan/水1l，EDTA可抑制脂蛋白中脂質(zhì)的氧化。

溶液②（d=1.182):NaBr24.98g溶于溶液①100ml中。

溶液③（d=1.478):NaBr78.32溶于溶液②100ml中。

0.15mol/LNaCl,0.3mlEDTA:8.77g NaCl、0.6ml的0.5mol/l EDTA（pH8.0)，再加雙蒸水到1L。

d=1.019液：1.851gKBr溶于溶液①100ml中。

d=1.063液：8.343gKBr溶于溶液①100ml中。

d=1.215液：33.496gKBr溶于溶液①100ml中。

以上溶液的密度，必要時(shí)用折射儀檢測(cè)。

2．操作

取10mlEDTA Na₂抗凝（1mg/ml)采血，離心（3000r/min)10min，分離得血漿。取血漿4ml加入容量10ml的超離心管中的底層，上面鋪蓋2ml溶液①(d=1.006)液，20kr/min(26kXg)離心30min(4℃)，不用制動(dòng)器讓其旋轉(zhuǎn)減速，以防飄浮物與下浮層相混；取出下層4ml混合血漿待用；超離心管中殘留2ml，再取溶液①2ml沿管壁加入，仔細(xì)混勻分散脂蛋白，又加溶液①2ml鋪在表面，20kr/min，4℃，離心1h，取出上層液直至變界處，此即CM組份。再將第一次離心所得的下層4ml混合血漿取出，其上鋪2ml溶液①，40kr/min（100k×g)，18℃離心17h，取上層1ml液，此即VLDL組份。再取出1ml至交界處，棄去，將管內(nèi)剩余的4ml混合液移入另一超離心管內(nèi)，取2ml溶液②（d=1.182)洗出離心管中殘余的脂蛋白，加入到裝4ml混合液超離心管內(nèi)，混勻，40kr/min，18℃，離心21h，取出上層（d=1.062)1ml混合液，此即LDL組份。繼續(xù)將中間層1ml除去，殘存的4ml轉(zhuǎn)入到另一超離心管內(nèi)，用d=1.478（溶液③)2ml洗滌原管，爾后移入4ml殘存液管內(nèi)，仔細(xì)混勻，40kr/min，18℃，離心41h，上層（d=1.20)部分吸出，即HDL組份。下層為VHDL（very high density Lipoprotein)與其他血漿脂蛋白。LDL與HDL分別對(duì)0.15mol/lNaCl-0.3mmol/L EDTA(pH8.0)透析，4℃保存。

三、從血漿直接分離LDL

用EDTA抗凝血，離心得血漿，可采用大容量（300ml)超離管進(jìn)行。血漿容量依次要加定量的KBr（Xg)，可按下述公式計(jì)算：

V為血漿容量（ml)數(shù)，d₁、d₂分別為該配制的最初的兩種溶液密度，υ為調(diào)節(jié)密度用的KBr的目的試劑水密度的偏比容。血漿d=1.006。首先調(diào)節(jié)溶液密度到d₂=1.019，離心除去。VLDL，d₂=1.019的υ為0.2922，即1ml血漿中應(yīng)當(dāng)加KBr0.01851g，溶解后，每管注入約16ml將d=1.019溶液8ml（0.5體積)覆蓋其上，40kr/min，18℃，離心16h，再除去黃色層以上的上層界面液，測(cè)量下層黃色層液ml數(shù)，再按上式計(jì)算添加0.0644g/mlKBr，以成d=1.063的溶液（υ=0.2982)同樣每管（16ml)加8ml的d=1.063溶液覆蓋其上，40kr/min，18℃，離心16h，取上層黃色區(qū)帶，并對(duì)0.15mol/lNaCl,0.3mmol/L EDTA(pH8.0)充分透析，該黃色脂蛋白即LDL，可用作LDL受體的配體。

添加KBr量計(jì)算式中的偏比溶（υ)，d=1.019、1.063、1.125、1.210、1.215的值相應(yīng)為0.2922、0.2982、0.3035、0.3090、0.3093。

四、硫酸右旋糖苷（DS)沉淀血清脂蛋白法

1．試劑

1%DS、10%DS、2mol/L CaCl₂、1mol/L K₂C₂O₄、12%NaCl、0.2mol/l Tris-HCl、0.9%NaCl、0.01mol/L EDTA(pH7.4)

2.操作

混合血清在3000r/min下，離心30min，除去血細(xì)胞及其他固體物質(zhì)，再以2000r/min離心30min（4℃)，以除去血清中的CM。

取一定體積的上述血清，加1%DS，使血清中的DS濃度為0.05%，加2mol/lCaCl₂，使血清中CaCl₂的終濃度為0.1mol/L，攪拌后放4℃冰箱過夜，于第二天離心（3750r/min)30min，將離心后的沉淀物溶解在12%NaCl中，而后加0.2mol/l Tris-HCl緩沖液250ml（pH7.4)，離心10min,棄去上清，將所得沉淀用0.02mol/l Tris-HCl再洗一次，此步驟要重復(fù)3次。將最后得到的VLDL和LDL溶解在7.5～15ml的1mol/L草酸鉀中（4℃)，3750r/min離心30分鐘，去掉沉淀，然后將此溶液在1%NaCl，1%BaCl₂溶液中透析48h（4℃)。將透析過的溶液放于離心管中去掉沉淀。把上清液再放入0.02mol/l Tris-HCl緩沖液透析72h，離心，其上清則含有較純的VLDL和LDL

五、無脂蛋白血清的制備

1．用途：無脂蛋白血清（lipoprotein deficient serum,LPDS)主要用于LDL受體活性測(cè)定的細(xì)胞培養(yǎng)。

2．操作：常規(guī)采血，室溫放置1～2h，以3kr/min離心10min，分離得到血清。向血清中按每1ml加0.33496g KBr，使其血清密度為d=1.215，或者按等體積加d=1.215的KBr液，按前述兩方法鋪在血清上面，按40kr/min(100k×g)速度，離心40h。離心完畢，將淡黃色上層脂蛋白與無色的中間層除去，下層液上再鋪d=1.215溶液，重復(fù)上述離心操作。將下層液，對(duì)0.15mol/l NaCl,0.3mmol/L EDTA(pH8.0) 溶液透析，用過濾器除菌，爾后分成小包裝貯存在-20℃?zhèn)溆谩?/p>

六、其他方法

除上述介紹的常用方法外，還有凝膠過濾和高壓液相層析法分離血漿脂蛋白的方法，有關(guān)參考書很多，在此不一一介紹。