動(dòng)脈粥樣硬化:第二節(jié)　載脂蛋白抗體的制備

抗原免疫動(dòng)物產(chǎn)生的抗體是血清γ-球蛋白的一部分�？贵w的理化性質(zhì)及結(jié)構(gòu)與γ-球蛋白相近似。γ-球蛋白是一組結(jié)構(gòu)相似，但又有差異的蛋白質(zhì)，通稱為免疫球蛋白（immunoglobulin,Ig)，按其結(jié)構(gòu)和免疫化學(xué)性質(zhì)的差異，又可分為五類，分別稱為IgG、IgA、IgM、IgD和IgE。載脂蛋白抗體以IgG最為穩(wěn)定。因載脂蛋白的體液中含量不同以及分離純化的難易的差別，可分別采用多克隆抗體制備法和單克隆抗體制備法。

1．多克隆抗體的制備

（1)抗原

目前所知的載脂蛋白進(jìn)入異種機(jī)體后，能致敏淋巴細(xì)胞，與抗體產(chǎn)生特異性結(jié)合復(fù)合物，即具備有抗原性。抗原性包括免疫原性和抗原特異性兩方面的含義。載脂蛋白因具備抗原特異性和免疫原性，因此可稱為完全抗原，大多數(shù)動(dòng)物的免疫系統(tǒng)是非常敏感的，用于免疫的抗原僅需要極微量。抗原應(yīng)該是純化品，該純品在12.5%的PAG電泳后，僅出現(xiàn)一條區(qū)帶，即認(rèn)為可用于免疫抗原純品。

（2)免疫

動(dòng)物的選擇：通常選擇壯年、成熟且健壯的豚鼠、雞、兔、山羊、zxtf.net.cn/job/綿羊、馬等動(dòng)物。一般多先用大白兔。作為批量生產(chǎn)，以采用山羊或綿羊，若需量再多，可考慮用馬作為免疫動(dòng)物。因動(dòng)物個(gè)體差異的關(guān)系，即使是用一種抗原去免疫多個(gè)白兔，所得抗血清特異性會(huì)有很大的差別。因此，為了得到比較一致的抗血清，常用能產(chǎn)生大量抗血清的羊或馬為免疫動(dòng)物。

佐劑：佐劑是指與抗原混合注入機(jī)體后，能增加抗原的免疫性或者能改變免疫反應(yīng)類型的一種物質(zhì)。人們公認(rèn)的佐劑是福氏佐劑（Freund’adguvant)，具有明顯的免疫剌激作用。福氏佐劑又可分為兩種，即不完全佐劑和完全佐劑，屬于一種油包水的乳劑，由羊毛脂或甘露糖醇單油酸酯（arlacela)為乳劑。油包水乳化劑有助于促進(jìn)免疫反應(yīng)的進(jìn)行，還可起部分保護(hù)不穩(wěn)定抗原的作用，使抗原在體內(nèi)的吸收期延長，從而減少加強(qiáng)注射的次數(shù)。在不完全佐劑內(nèi)加入殺死的分枝桿菌（如結(jié)核桿菌或卡介苗)制備成完全佐劑。分枝桿菌能增加局部淋巴結(jié)的炎癥反應(yīng)，擴(kuò)大免疫原性，從而促進(jìn)最終高親和力抗體的形成。佐劑有成品購買，也可自行制備。佐劑制備方法是，取石蠟油6份、羊毛脂4份，再加5份不含抗原的抗原緩沖液（含0.1%SDS),混勻，滅菌，分裝于小玻璃瓶中，0～8℃保存，此為不完全佐劑。在不完全佐劑中加入卡介苗（3～5mg/0.5ml)即為完全佐劑，均貯存于0～8℃。臨用時(shí)，取完全佐劑3份加入含抗原的緩沖液1份，混勻，振搖或研磨，使其成為乳化狀態(tài)，因?yàn)楹琒DS很易促使其乳化成油包水抗原乳化復(fù)合物，注射入動(dòng)物體內(nèi)時(shí)一定要保持乳化狀態(tài)�？乖�用量視抗原分子量不同及免疫原性及免疫動(dòng)物不同而有一定差異，無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)和固定模式。一般是每兔（約2kg重)或每羊（約20kg重)第1次注射抗原1mg，以后逐次增加抗原量，最多每次不超過3mg。

免疫途徑及方法：免疫部位可分別選用皮內(nèi)、皮下或淋巴結(jié)。第1次免疫采用皮內(nèi)結(jié)合皮下多點(diǎn)注射，常注射在背部或腿部。許多作者介紹在后足蹠皮下或皮內(nèi)注射，因?yàn)樗淖懵涞氐年P(guān)系很易造成感染，使第1次免疫失效，并使動(dòng)物行走不便，造成傷害。整個(gè)免疫過程以2～3個(gè)月為宜。一般是第1次免疫后的3～4周再進(jìn)行第2次免疫，不完全佐劑為乳化劑。2周后加強(qiáng)1次（不完全佐劑)，2周后又加強(qiáng)1次（不完全佐劑或完全佐劑)，1周后再免疫1次。待最后一次免疫后的7～10天，取靜脈血測(cè)試抗體效價(jià)（試血)，效價(jià)達(dá)到要求后即可一次性放血，采用頸動(dòng)脈放血，得抗血清。筆者采用此法先后免疫成功ApoAⅠ、AⅡ、B₁₀₀和E的抗血清。

（3)抗血清的保存

免疫成功的動(dòng)物放血過程，所有用具均嚴(yán)格消毒，并按無菌操作方式進(jìn)行放血�？寡�清的防腐劑以0.05%疊氮鈉為宜；也可采用加入20%～30%無菌甘油保存的方法。若時(shí)間較長，不用可采用-20℃低溫保存。一般在0～8℃保存1年，抗體效價(jià)幾乎無改變，保存2年，其效價(jià)稍有降低。抗體切忌反復(fù)凍融，否則抗體效價(jià)很快降低，以頸動(dòng)脈一次性放血為宜。

2．單克降抗體的制備

單克隆抗體是一種高度特異性的抗體。單克隆抗體與多克隆抗體有一定的差別�？贵w含量比較，單克隆抗體濃度高，腹水中可達(dá)0.5～10mg/ml，而多克隆僅0.1～1.0mg/ml；結(jié)合特性，單克隆抗體僅與單個(gè)抗原決定簇結(jié)合，特異性和親和力高，多克隆抗體可與所有抗原決定簇結(jié)合，特異性和親和力比較差；含免疫球蛋白類型，單克隆抗體僅一種亞類，多克隆抗體為所有種類和亞類。單克隆抗體在腹水中含量較高，可以人工培養(yǎng)，專一性強(qiáng)等特性是多克隆抗體無法比擬的優(yōu)點(diǎn)。

（1)單克隆抗體產(chǎn)生機(jī)理

單克隆抗體制備過程中需要兩種細(xì)胞和即骨髓瘤細(xì)胞和脾細(xì)胞。骨髓瘤細(xì)胞是一種惡變細(xì)胞，在體外有無限的增殖能力，并能分泌很多化學(xué)結(jié)構(gòu)均一的免疫球蛋白，但特異性很差，當(dāng)它與不同性質(zhì)的動(dòng)物脾細(xì)胞融合時(shí)，可形成雜交瘤細(xì)胞株。該細(xì)胞株在HAT培養(yǎng)基（內(nèi)含次黃嘌呤、氨基喋呤和胸腺嘧啶)中生長良好，而骨髓瘤細(xì)胞則在HAT培養(yǎng)基中不能生長。因?yàn)棰偃狈Υ吸S嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶，不能利用次黃嘌呤合成嘌呤；②氨基喋呤可阻止細(xì)胞內(nèi)嘌噙和胸腺嘧啶的合成。經(jīng)免疫的動(dòng)力脾細(xì)胞，不能在體外增殖，但是能產(chǎn)生相應(yīng)的特異抗體，可以與骨髓瘤細(xì)胞融合，并形成可分泌單克隆抗體的細(xì)胞株。

操作過程，一般是先把骨髓瘤細(xì)胞和經(jīng)免疫的脾細(xì)胞置在聚乙二醇（PEG)中進(jìn)行融合，然后在HAT培養(yǎng)液中選擇培養(yǎng)，由此得到雜交瘤細(xì)胞，采用有限稀釋法，即能把產(chǎn)生單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株篩選出來。該細(xì)胞再經(jīng)人工培養(yǎng)，或注射到小鼠體內(nèi)等亞克隆方法，即可得到單克隆抗zxtf.net.cn/Article/體。

（2)操作：以ApoAⅠ為例。①免疫小鼠：取ApoAⅠ500μg注射入小鼠腹腔內(nèi)，抗原以1：1的比例溶于完全福氏佐劑中乳化。每2～3周追加一次1：1不完全福氏佐劑抗原混合物，共3次。一般1次接種5～10只小鼠。從每只小鼠尾靜脈或眼眶取血，采用ELISA方法或單向免疫擴(kuò)散法鑒定抗體效價(jià)，用作鑒定的鼠血清至少按1：2000稀釋。在取出小鼠脾臟之前3天應(yīng)該再靜脈注射一次抗原以提高其效價(jià)；②培養(yǎng)骨髓瘤細(xì)胞：取HGPRT^-骨髓瘤細(xì)胞，經(jīng)HAT培養(yǎng)液培養(yǎng)，并取對(duì)數(shù)生長的細(xì)胞（細(xì)胞死亡數(shù)＜5%)供融合使用；③制備脾細(xì)胞：將接種免疫成功的小鼠脾臟取出（無菌操作)，放入裝有5ml冷水的不含血清DMEM（高葡萄糖)液中，勻漿，直至成為單細(xì)胞懸液（約10⁸細(xì)胞)，將脾細(xì)胞移入到一個(gè)50ml有蓋管內(nèi)，冰水中靜置5分鐘，待碎片沉淀后，將上清液移出。離心，NH₄Cl緩沖液溶解脾細(xì)胞中的紅細(xì)胞，得到脾細(xì)胞懸液（無紅細(xì)胞)；④細(xì)胞融合（雜交)增殖：取瘤細(xì)胞（10⁷)與脾細(xì)胞（6×10⁷)混合，再洗1次，制備雙份，分別用40%PEG1000（pH8.0)進(jìn)行融合，離心沉淀，于沉淀細(xì)胞中加RPM1-1604完全培養(yǎng)液稀釋。取此稀釋液0.5ml分別加到含腹腔細(xì)胞（HGPRT^-小鼠)的24孔板的每一孔穴中，置于37℃溫箱中，次日吸出0.5ml上清液，加入HAT溶液0.5ml。如此連續(xù)操作兩天，以后每隔2～3天重復(fù)1次，半月后改換HT培養(yǎng)液，再過半月后，改用RPM1-1604完全培養(yǎng)液，均處于37℃環(huán)境；⑤單克隆抗體細(xì)胞株篩選；當(dāng)雜交瘤細(xì)胞長滿孔穴的1/3時(shí)，即可對(duì)培養(yǎng)液中的抗體檢測(cè)，連續(xù)2次呈陽性孔穴，要立即克隆到預(yù)先加腹腔細(xì)胞（10⁴/孔)的96孔板中，每孔含有一個(gè)雜交瘤細(xì)胞，一般經(jīng)3～4天后克隆細(xì)胞開始增殖。接著再挑出陽性孔穴進(jìn)行克隆，這樣得到的上清液即為單克隆抗體；⑥雜交瘤細(xì)胞腹水單克隆抗體的制備：取0.5ml Pristane（2，6，10，14-四甲基十五烷)液注射入HGPRT^-小鼠腹腔內(nèi)，7～15天后，取0.5×10⁶～1.0×10⁶雜交瘤細(xì)胞以同一途徑進(jìn)行注射，15～30天后可以收集腹水5～10ml，抗體效價(jià)顯著增高；單克隆抗體制備過程如圖18-1所示；⑦細(xì)胞株的保存：于保存管中加入0.5～1.0ml保存液（含10%二甲基亞砜的小牛血清液)10⁶雜交瘤細(xì)胞株，置聚乙烯塑料盒。-40～-80℃過夜，爾后移至液氮罐保存。

圖 18-1 單克隆抗體的制備（源自：Goding JW.1987)

(3)抗體的檢測(cè)

抗體檢測(cè)可分別采用免疫火箭電泳法、單向擴(kuò)散法、免疫電泳法、ELISA法、免疫透射比濁法和放射免疫沉淀法。