1．目的基因的設計
在進行轉基因動物研究時，首先要針對實驗目的設計待轉移的目的基因，如隨機整合型基因或基因敲除（gene knockout)型載體基因。隨機整合型基因可來自于同一基因，也可來自于不同基因（拼接基因)。從結構上看，隨機整合型基因可分為結構基因與調控序列兩部分。若來自于同一個基因，那么該基因必須完整，包括5"上游啟動子區(qū)和3"下游的加尾信號（polyA signal)區(qū)等，可從基因組文庫中分離完整的基因。拼接基因應用更為廣泛，可通過選擇不同的啟動子來控制外源基因表達的組織特異性。進行基因剔除轉基因動物研究時，首先要設計與待剔除基因的同源性的載體基因，包括正負選擇標志基因，通過同源重組（同源取代或同源插入)而使目的基因失活，從而建立缺基因動物。在進行基因設計時，還應考慮轉基因動物的遺傳背景和設計相應的檢測方法，必要時設計一個報道基因（reporter gene)。
2．載體的選擇
運用轉基因動物研究基因表達，特別是在研究遺傳性疾病和進行基因治療時，選擇合適的基因載體是十分必要的。載體主要用于未克隆基因的擴增和選擇，有關實驗表明，載體有DNA序列可以干擾外源基因的表達，其原因可能與DNA的甲基化有關。最早用于哺乳類細胞表達載體的病毒是轉化型DNA病毒，如SV40和腺病毒。這些載體的主要缺點是接受外源DNA容量太小，只能攜帶約7～8kb的外源序列，因此這類載體不可能表達其他許多與疾病有關的功能基因。與其他載體相比，從鳥類和鼠類中獲得的逆轉錄病毒是目前應用廣泛的一類最有前途的載體。這類病毒為失去致病能力但仍有感染能力的缺陷病毒，如通常使用的禽白血病病毒和羅氏肉瘤病毒。這類病毒載體能有效地把外源基因導入哺乳動物靶細胞，其整合方式在結構和功能上較穩(wěn)定，功能基因插入和表達很容易。為避免逆轉錄病毒啟動子干擾和攜入誘變的可能性，許多研究者還構建出一類已被剪除了自身啟動子和增強子序列的逆轉錄病毒。這類失活載體只表達由基因攜帶的啟動子起始的載體編碼序列，但這種載體因其滴度低而使應用受到限制。近來有報道指出，利用帶有部分缺失失活的新霉素抗性基因（neor)的缺陷型整合逆轉錄病毒載體感染大鼠細胞，使整合到細胞中的neor缺陷基因功能得到恢復。非整合型病毒載體，如HSV載體已引起人們極大關注，這類病毒基因組較大（150kb)，它們具有比其他已知載體接受更大外源序列的能力，故能夠轉移和表達較大的基因。
3．背景及種系的選擇
由于不同種系的動物對zxtf.net.cn/zhuyuan/不同疾病的易感性不同，在進行轉基因動物研究時要考慮遺傳背景及種系的問題。許多實驗室在隨機雜交背景下建立了轉基因動物，同近親交配的轉基因動物相比，這一背景下產生的胚胎不但數量多，而且健康。盡管如此，隨機交配下的堿基分離可能影響轉基因動物的表型，降低了一個已知轉基因動物的作用。在混合遺傳背景下，堿基分離也直接影響基因動物的表達。已發(fā)現一種能夠直接抑制了轉基因的表達的種系特異性修飾因子（SSM-1)。在C57BL/6J鼠系中，SSM-1堿基分離直接抑制了轉基因的表達。相反，在DBA/2JSSM-1鼠中可交配的DBA/2J小鼠，可以消除SSM-1堿基分離產生變異的轉基因表達。
迄今為止，已相繼報道了小鼠、大鼠、兔、豬、牛和羊等轉基因的動物。目前，研究者均傾向于使用小鼠作轉基因的動物。最初的轉基因動物就是在小鼠體內完成的，已確定了小鼠的連鎖圖。盡管由于小鼠與人脂蛋白系統有很大差異，如小鼠缺乏膽固醇酯轉移蛋白（CETP)、載脂蛋白（a)[Apo（a)]和脂蛋白（a)[Lp（a)]，其多數膽固醇通過HDL而不像人那樣通過LDL進行運輸，但由于小鼠易于飼養(yǎng)管理，生長周期短，容易獲得已經定性的近交交配鼠和遺傳突變體，并且易于進行快速連鎖分析，其作為研究動物也較為經濟實惠，故常被用作建立轉基因動物模型。但小鼠對AS具有抗性，為使小鼠產生AS，必需喂養(yǎng)非生理性食物，包括1.25%的膽固醇（為人類飲食的10～20倍)，15%的脂肪和0.5%的膽酸（非正常食物組分)。嚴格地講，這種飼料是具有毒性的，但可使小鼠的非高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C)增至200～300mg/ml，4～5個月即可形成AS。
4．轉基因方法
進行轉基因動物研究的基因轉移方法有多種，如早期的畸胎癌細胞（teratocarcinoma cell,TCC)植入法、逆轉錄病毒感染法、顯微鏡注射法以及近幾年新出現的方法如電轉移法，精子載體法，胚胎干細胞（embryonal sterm cell,ES細胞)法、基因直接導入法等。其中較常用的三種方法有顯微注射法、逆轉錄病毒感染法和胚胎干細胞法（見圖23-1)。
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圖23-1 三種常用的轉基因方法
顯微注射法是直接將重組DNA分子以微注射的方式導入單細胞卵的原核中，再將它植入假孕母鼠。大約20%的微注射胚胎能夠將外源基因整合到染色體基因上組上；大多數的轉基因的動物能夠將整合的基因傳給后代，建立起轉基因鼠系。逆轉錄病毒感染法是用高滴度的、攜帶外源基因的重組逆轉錄病毒感染發(fā)育早期的胚胎，再將感染病毒后的胚胎植入假孕母鼠，以產生轉基因的動物。逆轉錄病毒的整合并不影響宿主DNA序列的重排，感染的復數容易調整，每個卵大約有10次整合的機會。病毒染色體還能提供一個TAG分子，加速覆蓋部位的迅速克隆。這些特征使逆轉錄病毒轉基因法用于研究隨機突變。從ES細胞到轉基因動物是從哺乳動物胚胎中分離出ES細胞，通過轉導或傳染的方法，將外源基因轉入ES細胞，再以微注射的方式將其植入鼠的胚胎。這種方法能夠將外源基因定位導入靶細胞染色體上某一特定部位，或使某一基因發(fā)生定點突變。
上述三種方法各具有優(yōu)缺點。顯微注射法相對整合率較高（1%～10%)，操作簡便，易于獲得成功。但外源基因通常以多拷貝串聯的形式隨機整合于受zxtf.net.cn/zhicheng/體基因組中，這種異常排列可能妨礙其表達的正常調節(jié)。逆轉錄病毒感染法的外源基因通常是單位點、單一拷貝整合，整合通常發(fā)生在逆轉錄病毒的長末端重復區(qū)（LTR)，從而保證了外源基因結構的完整性。但整合效率較低，而且操作比較繁瑣，能被導入的基因大小有一定限制（通常為10kb左右)。ES細胞法多只能建立嵌合體動物，如果注射有外源基因的ES細胞在胚胎內的發(fā)育過程中嵌合到生殖腺，則所建立的嵌合體動物不能把外源性基因傳給后代。但通過ES細胞法可以進行基因打靶（gene targeting)或基因剔除產生缺基因動物，這是目前建立某些疾病動物模型的一種新的有效途徑。
5．轉基因動物模型的建立
新出生的轉基因動物通過點雜交、聚合酶鏈反應（PCR)和免疫印跡雜交（Southern Northern blotting)等方法，先篩選出有外源基因整合的陽性動物，傳代后分別在mRNA和蛋白水平上檢測外源基因在轉基因動物中的表達情況，對外源基因表達產物的生物活性和生化性質進行鑒定，以及檢查轉基因動物的生理功能和是否出現某些疾病病癥狀的表型等。進一步培育和篩選出轉基因動物的純合子，或/和某些相關種系的動物雜交，從而建立某種疾病的轉基因動物模型。
利用轉基因技術培育人類疾病動物模型比用其他方法更加優(yōu)越，它可在動物原來遺傳背景的基因上，通過改變某種基因的表達水平而實現。這種模型模擬動物癥狀單一，接近于病人癥狀，產生這些疾病癥狀的原因是外源基因的轉入。轉基因動物模型可按照人們的愿望進行設計和培育，其建立過程的本身就可進行疾病機理的研究。由于轉基因動物的發(fā)育過程中又引入了時間和空間的因素，這樣就建立了一個立體的實驗動物體系，不但能從動物整體水平的組織器官水平上進行研究，而且還可以深入到細胞水平和分子水平，為發(fā)病機理、藥物篩選和臨床醫(yī)學研究提供了比較理想的實驗動物體系。自從1980年第一個轉基因動物問世以來，經過科學家們的不懈努力，已相繼建立了高脂血癥（HLP)、AS、高血壓、低血壓等心血管疾病的轉基因動物模型。其中應用最廣的是各種轉基因小鼠（TGM)模型。
