| 公開(kāi)(公告)號(hào) | CN1699558A |
| 公開(kāi)(公告)日 | 2005.11.23 |
| 申請(qǐng)(專利)號(hào) | CN200510035036.4 |
| 申請(qǐng)日期 | 2005.06.09 |
| 專利名稱 | 使用生物反應(yīng)器對(duì)造血干細(xì)胞來(lái)源的細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞的大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù) |
| 主分類號(hào) | C12N5/08 |
| 分類號(hào) | C12N5/08 |
| 分案原申請(qǐng)?zhí)? | |
| 優(yōu)先權(quán) | |
| 申請(qǐng)(專利權(quán))人 | 鄭麗琴 |
| 發(fā)明(設(shè)計(jì))人 | 郭杰標(biāo) |
| 地址 | 512026廣東省韶關(guān)市芙蓉新城碧島豪庭A座804 |
| 頒證日 | |
| 國(guó)際申請(qǐng) | |
| 進(jìn)入國(guó)家日期 | |
| 專利代理機(jī)構(gòu) | 韶關(guān)市雷門(mén)專利事務(wù)所 |
| 代理人 | 周勝明 |
| 國(guó)省代碼 | 廣東;44 |
| 主權(quán)項(xiàng) | 一種使用生物反應(yīng)器對(duì)造血干細(xì)胞來(lái)源的細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞的大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)，包括臍帶血造血干細(xì)胞的獲得，以細(xì)胞因子將造血干細(xì)胞誘導(dǎo)成DC細(xì)胞、并完成對(duì)腫瘤抗原的提呈作用，完成對(duì)腫瘤具有特異性殺傷作用的殺傷性T淋巴細(xì)胞的選擇激活，以化學(xué)法連接抗CD3單抗的瓊脂糖微載體的制備，CIK細(xì)胞的激活和CIK細(xì)胞在生物反應(yīng)器中進(jìn)行連續(xù)培養(yǎng)，其特征是：所述以化學(xué)法連接抗CD3單抗的瓊脂糖微載體的制備是以共價(jià)方法將單抗連接在微載體上，提高單抗與細(xì)胞的接觸面積，增大培養(yǎng)空間，提高細(xì)胞密度，又可以在空間實(shí)現(xiàn)樹(shù)突狀細(xì)胞、輔助性T細(xì)胞、殺傷性T細(xì)胞之間的接觸，便于腫瘤抗原的提呈和殺傷性T細(xì)胞的選擇激活，由于CIK細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)現(xiàn)立體化，所以可以使用生物反應(yīng)器進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng)，將瓊脂糖微載體在pH為10.5-11的0.1MTris緩沖液中和加入溴化氰使終濃度為0.1M，在搖床上20-25℃作用過(guò)夜；1500轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘，使瓊脂糖微載體和溴化氰反應(yīng)液分離，用pH為11的Tris緩沖液洗滌/離心5次，將活化的瓊脂糖微載體風(fēng)干備用，將瓊脂糖微載體和抗CD3抗體以1g/3-5mg的比例，在pH為9.5-10的0.1MTris緩沖液中混合，在搖床上20-25℃作用1小時(shí)，使抗CD3抗體充分結(jié)合到瓊脂糖微載體上，加入足夠量的甘氨酸封閉瓊脂糖微載體未反應(yīng)的位點(diǎn)，用DMEM培養(yǎng)液洗滌離心10次，將微載體在4-8℃風(fēng)干后，用鈷60輻照滅菌后備用；所述CIK細(xì)胞的激活是將完成對(duì)腫瘤具有特異性殺傷作用的殺傷性T淋巴細(xì)胞的選擇激活中處理過(guò)的臍帶血造血干細(xì)胞以0.8-1×108個(gè)細(xì)胞/1g微載體的比例混合，在培養(yǎng)瓶中以含有10％胎牛血清和終濃度為300-500ng/ml的IL-2的PMRI1640完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，這時(shí)臍帶血造血干細(xì)胞中含有的單核細(xì)胞和殺傷性T細(xì)胞會(huì)在連接和微載體上的抗CD3單抗和IL-2的作用下被激活成為CIK細(xì)胞，進(jìn)入快速生長(zhǎng)的狀態(tài)，在抗CD3單抗的支持下生長(zhǎng)8-10天后，CIK細(xì)胞會(huì)逐漸成熟并擺脫對(duì)抗CD3單抗的依賴，這時(shí)可以將細(xì)胞轉(zhuǎn)入到生物反應(yīng)器中進(jìn)行大規(guī)模連續(xù)培養(yǎng)；所述CIK細(xì)胞在生物反應(yīng)器中進(jìn)行連續(xù)培養(yǎng)：采用攪拌式生物反應(yīng)器，以攪拌速度60-80轉(zhuǎn)/分鐘，溶氧量為45-55％，pH為7.2，溫度為37℃，培養(yǎng)基替換速度為1-1.5ml/分鐘的條件進(jìn)行培養(yǎng)，能夠?yàn)榧?xì)胞提供穩(wěn)定而合適的生長(zhǎng)條件，而反應(yīng)器的細(xì)胞截留裝置使細(xì)胞能夠保持高密度狀態(tài)，使CIK細(xì)胞能夠得到長(zhǎng)時(shí)間、高密度地培養(yǎng)，當(dāng)反應(yīng)器內(nèi)的細(xì)胞密度達(dá)到3-5×107之后，就可以每天收集500-800ml的細(xì)胞培養(yǎng)液，得到2-4×1010的CIK細(xì)胞，剩余的細(xì)胞繼續(xù)在反應(yīng)器內(nèi)進(jìn)行連續(xù)培養(yǎng)、連續(xù)收集。 |
| 摘要 | 本發(fā)明涉及一種使用生物反應(yīng)器對(duì)造血干細(xì)胞來(lái)源的細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞的大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)，包括臍帶血造血干細(xì)胞的獲得，以細(xì)胞因子將造血干細(xì)胞誘導(dǎo)成DC細(xì)胞、并完成對(duì)腫瘤抗原的提呈作用，完成對(duì)腫瘤具有特異性殺傷作用的殺傷性T淋巴細(xì)胞的選擇激活，以化學(xué)法連接抗CD3單抗的瓊脂堂微載體的制備，CIK細(xì)胞的激活和CIK細(xì)胞在生物反應(yīng)器中進(jìn)行連續(xù)培養(yǎng)。本發(fā)明以共價(jià)方法將單抗連接在微載體上，既提高了單抗與細(xì)胞的接觸面積，增大培養(yǎng)空間，提高細(xì)胞密度；又可以在空間實(shí)現(xiàn)樹(shù)突狀細(xì)胞、輔助性T細(xì)胞、殺傷性T細(xì)胞之間的接觸，便于腫瘤抗原的提呈和殺傷性T細(xì)胞的選擇激活；CIK細(xì)胞使用生物反應(yīng)器進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng)。 |
| 國(guó)際公布 |
