| 公開(公告)號 | CN1865430A |
| 公開(公告)日 | 2006.11.22 |
| 申請(專利)號 | CN200510013514.1 |
| 申請日期 | 2005.05.16 |
| 專利名稱 | 一種高產(chǎn)促胰島素激素的畢赤酵母工程菌及其構(gòu)建方法 |
| 主分類號 | C12N1/19(2006.01)I |
| 分類號 | C12N1/19(2006.01)I;C12N15/81(2006.01)I;C12N15/66(2006.01)I;C12N15/10(2006.01)I;C07H21/00(2006.01)I;C12R1/84(2006.01)N |
| 分案原申請?zhí)? | |
| 優(yōu)先權(quán) | |
| 申請(專利權(quán))人 | 南開大學(xué) |
| 發(fā)明(設(shè)計(jì))人 | 李明剛;侯建華;方園園;薄 濤;王翠艷;楊少輝;武志強(qiáng);閆瑞香 |
| 地址 | 300071天津市衛(wèi)津路94號 |
| 頒證日 | |
| 國際申請 | |
| 進(jìn)入國家日期 | |
| 專利代理機(jī)構(gòu) | 天津市學(xué)苑有限責(zé)任專利代理事務(wù)所 |
| 代理人 | 鄭 楠 |
| 國省代碼 | 天津;12 |
| 主權(quán)項(xiàng) | 一種促胰島素激素高產(chǎn)畢赤酵母工程菌的構(gòu)建方法，其特征在于包括： a)構(gòu)建畢赤酵母(P.pastoris)表達(dá)載體pPIC9GLP-1： 根據(jù)畢赤酵母表達(dá)載體pPIC9質(zhì)粒多克隆位點(diǎn)的序列特點(diǎn)，設(shè)計(jì)上游引物和下游引物，將克隆的GLP-1直接連入T-vector得到pMDGLP-1，用SmalI和NotI酶切得到GLP-1基因片段；質(zhì)粒pPIC9用XhoI酶切后補(bǔ)平粘端；再用NotI酶切，回收大片段；將GLP-1基因片段與pPIC9大片段通過T4DNA連接酶連接，篩選陽性轉(zhuǎn)化子從而完成畢赤酵母表達(dá)載體pPIC9GLP-1的構(gòu)建； b)構(gòu)建畢赤酵母GLP-1生產(chǎn)菌株： 重組質(zhì)粒pPIC9GLP-1用SacI酶切使之線性化，再以醋酸鋰轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化畢赤酵母菌株GS115感受態(tài)細(xì)胞；在MD培養(yǎng)基上培養(yǎng)兩天，挑取陽性轉(zhuǎn)化子，獲得畢赤酵母GLP-1生產(chǎn)菌株； c)篩選畢赤酵母GLP-1高產(chǎn)菌株： 通過PCR、Southern雜交和Western blot等方法對轉(zhuǎn)化子進(jìn)行分子檢測，確證GLP-1基因已整合到基因組并正確表達(dá)；將各轉(zhuǎn)化子畢赤酵母細(xì)胞接種于BMGY液體培養(yǎng)基中，30℃振蕩培養(yǎng)40～48小時(shí)，250r/min，無菌條件下離心棄上清，換成BMMY液體培養(yǎng)基；在誘導(dǎo)過程中，每24小時(shí)加入適量甲醇使其終濃度維持在0.75％附近；培養(yǎng)60小時(shí)后離心收集各轉(zhuǎn)化子的上清培養(yǎng)基；用Tricine SDS-PAGE蛋白質(zhì)電泳和密度掃描法檢測轉(zhuǎn)化子的GLP-1的分泌表達(dá)產(chǎn)量，篩選出畢赤酵母GLP-1高產(chǎn)菌株。 |
| 摘要 | 本發(fā)明公開了一種高產(chǎn)促胰島素激素畢赤酵母(Pichia pastoris)工程菌及其構(gòu)建方法。本發(fā)明運(yùn)用分子生物學(xué)技術(shù)先構(gòu)建畢赤酵母(P.pastoris)表達(dá)載體pPIC9GLP-1，然后將其線性化后轉(zhuǎn)化進(jìn)入畢赤酵母GS115中，從而獲得能夠高效分泌表達(dá)促胰島素激素的畢赤酵母工程菌，該工程菌的促胰島素激素產(chǎn)量可達(dá)到100mg/L。同時(shí)，利用該高產(chǎn)工程菌生產(chǎn)的促胰島素激素產(chǎn)品，其氨基酸序列不同于天然產(chǎn)品，且已被消除了胰蛋白酶切位點(diǎn)，因此不僅在體內(nèi)不會(huì)被特異性的蛋白酶降解而能夠長時(shí)間的保持活性，而且由于不會(huì)被胰蛋白酶降解，還可以制成口服制劑使用。 |
| 國際公布 |
