生物化學(xué)-實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)

項(xiàng)目性質(zhì)：研究性

實(shí)驗(yàn)學(xué)時(shí)：4

分組人數(shù)：1人

實(shí)驗(yàn)原理:

蛋白質(zhì)中的酪氨酸等與酚試劑之磷鉬酸、磷鎢酸作用產(chǎn)生藍(lán)色化合物，其顏色深淺與蛋白質(zhì)含量成正比。

福林—酚法測(cè)定蛋白質(zhì)的反應(yīng)原理可分為兩個(gè)步驟：

1.在堿性溶液中，蛋白質(zhì)與銅離子發(fā)生反應(yīng)：

Cu⁺⁺ + 蛋白質(zhì)→ Cu-蛋白質(zhì)

2.Cu-蛋白質(zhì)使試劑中的磷鎢酸—磷鉬酸還原成為藍(lán)色化合物，測(cè)定光吸收值就可以推算出蛋白質(zhì)的含量。試劑中的碳酸鈉有緩沖作用，使溶液的pH值保持在10左右，顯色最深。福林—酚法的靈敏度高、蛋白質(zhì)濃度測(cè)定范圍是25～250μg。

但此法實(shí)際上是蛋白質(zhì)中酪氨酸和色氨酸等與試劑的反應(yīng)，因此它受蛋白質(zhì)氨基酸組成的影響，即不同蛋白質(zhì)中氨基酸組成的不同會(huì)使顯色強(qiáng)度有所差別；此外，樣品中酚類及檸檬酸的干擾而使結(jié)果偏高。低濃度的尿素（約0.5%左右)、胍（0.5%醫(yī).學(xué)全在線zxtf.net.cn左右)、硫酸鈉（1%)、硝酸鈉（1%)、三氯醋酸（0.5%)、乙醇（5%)、丙酮（0.5%)對(duì)顯色無(wú)影響，上述物質(zhì)濃度高時(shí)必須做校正曲線。

操作步驟：

1.制作標(biāo)準(zhǔn)曲線

(1) 標(biāo)準(zhǔn)蛋白的選擇： 最好選擇與待測(cè)樣品相同或組成類似的蛋白質(zhì)作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液。

(2) 標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液的配制：將標(biāo)準(zhǔn)蛋白經(jīng)凱氏定氮法準(zhǔn)確測(cè)定其蛋白質(zhì)含量，再用無(wú)離子水配制成1.0 mg/ml的儲(chǔ)存液。

(3) 按照表1  配成不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)蛋白組，編上號(hào)碼，以第一管為空白管，在分光光度計(jì)上測(cè)定650nm處的光密度值。

表1  不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)蛋白組配置

(4)  以各標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，各管的光密度值為縱坐標(biāo)作圖，作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

標(biāo)準(zhǔn)曲線必須從零點(diǎn)出發(fā)，最好能成一直線，畫好后，注明所用儀器的型號(hào)及編號(hào)，所用波長(zhǎng)及測(cè)定方法，名稱及制做日期。

2. 樣品蛋白的測(cè)定: 取試管2只，按表2 操作。

   表2  樣品蛋白的測(cè)定

    注意：各管加酚試劑必須快速，并立即搖勻，不應(yīng)出現(xiàn)渾濁；測(cè)定蛋白質(zhì)的濃度最好在15～110μg范圍。

試劑：

1.試劑A：2g酒石酸鉀鈉及100g Na₂CO₃ 溶于500ml 1.0mol/L NaOH 中，用水稀釋至1000ml。

2.試劑B：2g酒石酸鉀鈉及1g CuSO₄.5H₂O分別溶于少量水中,混合后加水至90ml再加1mol/L NaOH 10ml即成。

3.試劑C：市售的酚試劑按1：15稀釋，最后濃度為0.15-0.18mol/L(用標(biāo)準(zhǔn)NaOH 滴定)。

稱取Na₂WO₄.2H₂O及Na₂MoO₄.2H₂O 各25g溶于蒸餾水700ml中，加入85% H₃PO₄ 50ml、濃HCl 100ml，混勻后，置圓底燒瓶中加熱回流10小時(shí)，加入Li₂SO₄.H₂O 150g、蒸餾水50ml及溴水（Br₂)數(shù)滴，溶液變?yōu)榧t黃色，置通風(fēng)櫥內(nèi)加熱沸騰15分鐘蒸發(fā)Br₂，溶液呈透明的金黃色，冷卻后加蒸餾水定容至1000ml，過(guò)濾，置棕色瓶中保存，用標(biāo)準(zhǔn)NaOH標(biāo)定其濃度，應(yīng)用時(shí)用蒸餾水稀釋至濃度為0.15～0.18mol/L。

溶液中的硫酸鋰能防止磷鉬酸沉淀，溴可以氧化試劑中的還原物質(zhì)，使其不致干擾顯色。4.標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液：稱量干燥的人血清白蛋白（BSA)或丙種球蛋白10mg，用生理鹽水配制成1mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液。

5.生理鹽水。

思考題：

1.Lowry 法測(cè)蛋白的反應(yīng)原理及試用范圍？

2.測(cè)量蛋白的方法有幾種？各自的優(yōu)點(diǎn)是什么？

實(shí)驗(yàn)性質(zhì)：驗(yàn)證性

實(shí)驗(yàn)學(xué)時(shí)：4

分組人數(shù)：1

（一)實(shí)驗(yàn)原理

以唾液淀粉酶為例。

1. 溫度對(duì)酶活性的影響

（內(nèi)容原理)

(C₆H₁₀O₅)_n  (C₆ H₁₀O₅)_n      C₁₂H₂₂O₁₁

淀粉(膠體液乳狀光澤)      糊精      麥芽糖   

（1)與碘反應(yīng)呈不同顏色，藍(lán)、紫、紅等，由淀粉斷裂而成大小不等情況而定。

（2)不與碘呈色，淀粉空間結(jié)構(gòu)被完全破壞。 

（3)與碘反應(yīng)呈藍(lán)色（直鏈淀粉)。  

（技術(shù)原理)

     判斷  間接判斷  

碘   是否水解；水解程度     淀粉酶的活性大小  

   淀粉與碘反應(yīng)后的顏色

2. pH對(duì)酶活性的影響  唾液淀粉的最適pH為6.9。

用碘判斷底物淀粉消失的快慢，間接判斷酶活性高低。

3. 激動(dòng)劑、抑制劑對(duì)酶活性的影響。

非必需激動(dòng)劑：Cl^-離子

  唾液淀粉酶

強(qiáng)烈抑制劑：Cu²⁺離子

 （二)操作

1. 收集唾液

脫脂棉過(guò)濾，   2 ml（0℃-4℃水浴5分鐘待用)   5~10倍  濾液  其余37℃水浴保存  

2. 溫度對(duì)酶活性的影響

分組：見(jiàn)表6-36。

表6-36  溫度對(duì)酶活性的影響加樣

   1 2   3  4  備注

第1步   20滴 20滴  20滴 20滴   10g/L淀粉

第2步   0℃-4℃水浴5min 37℃水浴5min   冷溫處理

第3步   預(yù)冷唾液10滴   預(yù)冷唾液10滴  唾液10滴   煮沸唾液10滴 唾液

第4步  攪勻0℃-4℃水浴5min   攪勻3 7℃水浴5min  冷溫處理

第5步   2滴    37℃水浴10min 2滴   2滴  2滴   碘液 

加唾液后應(yīng)混勻各管，加碘液后搖勻，觀察并解釋結(jié)果。

3. pH對(duì)酶活性影響

（1)分組：見(jiàn)表6-37。

   表6-37  pH對(duì)酶活性影響加樣

管號(hào)

1 2   3

磷酸鹽緩沖液   pH5.0 2 ml  pH6.8 2 ml pH8.0 2 ml

10 g/L淀粉液   2 ml  2 ml   2 ml

稀釋唾液   10滴  10滴  10滴

（2)比色：取瓷比色盤一個(gè)，預(yù)先在各池中分別加滴稀碘液。

每隔1分鐘從第3管中吸取溶液1滴，加到已加有碘液的比色盤小池中，直至此管溶液與碘呈棕色向各試管加碘液2滴，搖勻觀察。

4. 激動(dòng)劑、抑制劑對(duì)酶活性的影響

（1)分組（試管)：見(jiàn)表6-38。

表6-38  激動(dòng)劑、抑制劑對(duì)酶活性的影響加樣

（2)比色：取瓷比色盤1個(gè)，預(yù)先加入一排碘液，各池1~2滴。

 每隔1分鐘從第3管吸取保溫液1滴測(cè)碘反應(yīng)，直至與碘呈棕色，向各試管加碘液2滴，搖勻觀察。

（三)實(shí)驗(yàn)材料

（1)10g/L淀粉液。

（2)碘液：稱取I₂ 1g，KI 2g，同溶于100 ml蒸餾水中，貯于棕色瓶。

（3)10g/L NaCl。

（4)10 g/L CuSO₄。

（5)10 g/L Na₂SO₄。

（6)磷酸鹽緩沖液

1)pH 5.0，0.2mol/L磷酸氫二鈉在pH計(jì)下以0.2mol/L鹽酸調(diào)節(jié)至pH5.0。

2)pH 6.8，1/15 mol/L磷酸氫二鈉49.6ml加入1/15 mol/L磷酸二氫鉀50.4ml。

3)pH 8.0，1/15 mol/L磷酸氫二鈉94.7ml加入1/15 mol/L磷酸二氫鉀5.3 ml。

（四)思考題

系統(tǒng)歸納溫度、pH及激動(dòng)劑、抑制劑對(duì)酶活性的影響。

實(shí)驗(yàn)性質(zhì)：驗(yàn)證性

實(shí)驗(yàn)學(xué)時(shí)：4

實(shí)驗(yàn)分組人數(shù)：1

實(shí)驗(yàn)原理

從不同組織、細(xì)胞中獲得高質(zhì)量的DNA是進(jìn)行各種研究的先決條件。DNA以核蛋白形式存在于細(xì)胞核中，制備DNA的原則是既要將蛋白質(zhì)、脂類、糖類等物質(zhì)分離干凈、又要盡可能保持DNA分子的完整。為了獲得大分子量的DNA，一般采用蛋白酶K和去污劑溫和處理法。

在提取DNA的反應(yīng)體系中，SDS將細(xì)胞膜、核膜破壞，并將組蛋白等從DNA分子上拉開，SDS及EDTA抑制細(xì)胞中DNA酶的活性，蛋白酶K將所有蛋白降解成小肽和氨基酸，隨后用酚--氯仿抽提,將蛋白質(zhì)和DNA分離,得到較純的DNA分子。

操作

1.取動(dòng)物新鮮組織約50mg，用預(yù)冷的生理鹽水洗去表面殘血，剪碎，加入450μl STE裂解液和50μl 10%SDS至終濃度為0.5%，勻漿后再加入10mg/ml的蛋白酶K5μl至終濃度為100μg/ml， 置55℃水浴箱保溫3小時(shí)。

2.取500μl反應(yīng)液加入等體積Tris·Cl(pH8.0)飽和酚，顛倒混勻10 min，4000rpm離心5min。

3.取上層粘稠水相，加入酚：氯仿∶異戊醇(25：24∶1)液至1ml，顛倒混勻10min，4000rpm離心5min。

4.取上層水相，加氯仿∶異戊醇(24∶1)液至1ml，顛倒混勻5min，4000rpm離心5min。

5．取上層水相，加1／10體積pH5.2的3M NaAC,加入預(yù)冷的無(wú)水乙醇至1ml，緩慢搖動(dòng)混勻，可見(jiàn)乳白色絲狀DNA沉淀出現(xiàn)，12000rpm離心15min。

6.棄上清，向沉淀中加75%乙醇500μl漂洗，12000rpm離心3min。

7.棄上清，沉淀室溫干燥，加入100μlTE溶解。

實(shí)驗(yàn)試劑

1．STE裂解液：

 5ml 1M Nacl

0.5ml   1M Tris-cl   (PH8.0)

0.1ml   0.5M EDTA  (PH8.0)

加水定容至 50 ml。

2、10%SDS

3．10mg/ml蛋白酶K

4．Tris-HCl(pH8.0)飽和酚

5．酚：氯仿：異戊醇 (25：24：1)液

6．氯仿：異戊醇 (24：1)

7．3M NaAC（pH5.2)溶液

8．冷無(wú)水乙醇

9．75%乙醇

10．TE： 10mM Tris-HCl(pH7.6), 1mM EDTA(pH8.0)

注意事項(xiàng)

1．.獲得高分子質(zhì)量DNA的關(guān)鍵之一是防止DNase降解。標(biāo)本必須新鮮。在提取前，細(xì)胞應(yīng)保持完整，核和溶酶體等細(xì)胞器應(yīng)沒(méi)有明顯破壞。提取DNA用的離心管等器皿及試劑應(yīng)提前消毒，操作時(shí)要盡可能在10℃以下。在提取DNA的過(guò)程中還應(yīng)盡量避免DNA的機(jī)械剪切作用，因此在抽提過(guò)程中應(yīng)盡可能避免劇烈振蕩。

2．除組織外，外周血白細(xì)胞、胎兒羊水細(xì)胞、胎盤以及培養(yǎng)細(xì)胞也是大量提取DNA的最適宜來(lái)源。

思考題

1. DNA提取過(guò)程中為什么不能劇烈震蕩。

2. 如何進(jìn)行細(xì)胞的破碎。