實驗八 血痕的DNA提取及STR分析
熟悉掌握Chelex法提取血痕DNA的方法，掌握PCR反應(yīng)的原理和方法，以及STR分析方法；了解血痕DNA提取的常見方法。
【實驗內(nèi)容】
一、 血痕DNA提取
在DNA分析技術(shù)運用于實際檢案的過程中，血痕是最常見的檢材之一。對血痕提取DNA，再進行PCR擴增特定基因位點，然后電泳顯色檢測，這是常用的法醫(yī)物證檢驗方法。目前，用于提取血痕DNA的方法很多，不同的方法有不同的優(yōu)缺點，其適用的分析技術(shù)也不同。而且，法醫(yī)檢案的實際應(yīng)用過程中經(jīng)常遇。所以，在血痕DNA提取方面，我們應(yīng)該了解多一點的方見不少問題，比如：微量血痕的DNA提取，血痕中含有過量的雜質(zhì)等等法。因此，本次試驗介紹以下幾種常用的血痕DNA提取的方法，供同學(xué)們學(xué)習(xí)。分別是：Chelex-100法、酚－氯仿法、堿性裂解法、以及這些方法的改良。
﹙一﹚ Chelex-100法
1. 原理
細胞中的DNA一般與蛋白質(zhì)結(jié)合，提取DNA的過程就是破碎細胞，去除與DNA結(jié)合的蛋白質(zhì)、多糖、脂類﹙也包括去除其他核酸﹚，最后分離、純化所需的DNA過程。在DNA的提取方法中，我們需用到蛋白酶K、SDS。蛋白酶K的作用是消化與DNA結(jié)合的蛋白質(zhì)，釋放DNA。SDS的作用是破壞細胞膜、核膜，并使組蛋白等從DNA分子上解聯(lián)。Chelex-100法中, chelex是一種以亞氨二乙酸為吸附因子的苯乙烯與二乙基苯的共聚物，對多價金屬離子有鰲和作用，可防止DNA在煮沸加熱時被降解，同時在高溫低離子強度下還有催化DNA釋放的作用。這樣既可減少DNA的損失，又可消除擴增中的一些抑制因素，因此血痕DNA采用chelex-100法，由于其快速、實用而被廣大法醫(yī)物證工作者所用。
2. 儀器設(shè)備與試劑
(1) 儀器設(shè)備
離心機、進樣器、1.5mlEppendorf離心管、水浴鍋、振蕩器。
(2) 試劑
滅菌去離子水，chelex-100
3. 方法
（1) 檢材用量：對于大量血痕﹙如血紗布﹚，剪取約1×1cm2大小，不可過多否則會抑制PCR反應(yīng)。如果血痕屬微量血痕，可直接用進樣器吸取20－40ul滅菌去離子水，然后在血痕處反復(fù)吹打，將血痕盡可能的洗下來并裝入離心管中。
（2) 取適量血痕檢材置1.5mlEP管中，加入1ml滅菌無菌水浸泡20min，10000rpm離心3min，用1000ul進樣器小心地吸去上清液。
（3) 加5％chelex-100 200ul，于水浴鍋中56℃水浴30min，振蕩混勻。
（4) 沸水中煮10min，取出后立即置于冰上3min，10000rpm離心1min。上清液即為DNA提取液，可在2－6℃保存1個月，在－20℃長期保存。
【注意事項】
對部分陳舊、或污染有多量泥沙、載體吸附力強或色素深的血痕檢材，經(jīng)一次chelex-100的處理，仍不能擴增成功，這可能是由于以下幾個原因：
a) 血痕過于陳舊，血色素無法溶解下來，使血色素對擴增的抑制增強，導(dǎo)致擴增失敗。
b) 血痕受泥沙或載體色素的影響，使擴增受到抑制。
c) 血痕載體吸附力強，導(dǎo)致DNA提取率降低。
d) 血痕量太少，超出檢驗靈敏度。
針對以上幾種影響因素，進行一些改良處理：
a) 對難于溶解的陳舊血痕，可加入1／10體積的10％SDS，促進血色素的溶解，易于洗滌，減少血色素對擴增的抑制。
b) 對受泥沙或載體色素影響的血痕，可對首次DNA提取液進行二次提取，使模板被稀釋，減少載體的干擾，進一步去除模板中的擴增抑制物。
c) 對載體吸附能力強的血痕，可增加浸泡時間，同時也可結(jié)合上述方法。
d) 對于量少而受污染的血痕，經(jīng)上述處理后，再經(jīng)超濾柱濃縮，使模板DNA濃度達到可檢測范圍。在檢案過程中，檢材經(jīng)常是受多種因素的影響，因此可綜合利用上述幾種處理方法。
﹙二﹚ 酚－氯仿法
1. 原理：
本試驗采取酚、氯仿反復(fù)抽提，是與DNA結(jié)合的蛋白質(zhì)解離、去除。氯仿可使蛋白質(zhì)變性并有助于液相與有機相的分離。酚起萃取作用。試驗中還要用到異戊醇，有助于消除抽提過程中出現(xiàn)的泡沫。
2. 儀器設(shè)備與試劑
(1) 儀器設(shè)備：
水浴鍋、振蕩器、離心機、進樣器、1.5mlEP管
(2) 試劑：
滅菌去離子水、STE﹙氯化鈉、Tris、EDTA﹚緩沖液、蛋白酶K、10％SDS、苯酚／氯仿／異戊醇混合物﹙25：24：1﹚、氯仿／異戊醇混合物﹙24：1﹚、5mol/L氯化鈉、70％乙醇
3. 方法：
（1) 取適量血痕檢材置于1.5ml EP管中，加入1ul無菌水浸泡20min，>10000rpm離心3min，棄去上清。
（2) 加入500ul STE液懸浮沉淀物，加入20ul10％SDS及10mg/ml蛋白酶K4ul，54℃水浴消化3h。
（3) 離心取上清液至另一EP管中，加入500ul苯酚／氯仿／異戊醇混合物，振蕩到出現(xiàn)絮狀物，>10000rpm離心3min。
（4) 轉(zhuǎn)移上層水相至另一EP管中，加入／氯仿／異戊醇混合物，振蕩，>10000rpm離心3min。
（5) 取上層水相，加入30ul 醫(yī)學(xué)考研網(wǎng)5mol/L氯化鈉和1ul冰無水乙醇，振蕩，10000rpm離心3min，去除乙醇。
（6) 取絮狀物加入500ul 70%乙醇，振蕩，＞10000rpm離心3min。
（7) 棄去上清液，加入無菌水100uL使其溶解，4℃保存?zhèn)溆谩?/P>
【注意事項】
酚-氯仿法是目前最常用、最可靠的方法之一，無論是血液還是血痕標本均適用，所提取的DNA純度高，可滿足各種分子生物學(xué)檢測技術(shù)的需要，但該法操作較為繁瑣、耗時長，影響了其在實踐工作中的廣泛應(yīng)用。
（三)堿性裂解法
1. 原理：
堿性裂解法是指在強堿作用下，使構(gòu)成細胞的蛋白質(zhì)成分谷氨酸、天冬氨酸、氨酸殘基等迅速發(fā)生電離，從而快速破壞蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)。正因為強堿對蛋白質(zhì)有強烈的變性乃至裂解作用，所以，檢材在強堿性pH條件及一定溫度狀況下能迅速破碎細胞膜及核膜，使核酸酶變性及DNA釋放。此時，DNA的一級結(jié)構(gòu)是相對完整的。這個原理在細菌質(zhì)粒DNA提取中運用較多。
2. 儀器設(shè)備與試劑：
(1) 儀器設(shè)備：
0.5ml EP管、水浴鍋、離心機
(2) 試劑：
裂解液 0.2mol/LNaOH溶液（國產(chǎn)分析純)。
中和液 0.04mmol/LTris-HCL（PH 7.5)進口分裝。
3. 方法：
（1) 取適量血痕于0.5mlEP管中，加入20ul0.2mol/LNOH溶液，80℃保溫5min（若為陳舊血痕，可適當增加保溫時間5-10min)。
（2) 加入180ul0.04mmol/L Tris-HCL（pH7.5)。離心，4℃保存?zhèn)溆谩?
【注意事項】
血痕要求在75~80℃之間保溫5min，若檢材為陳舊性，尚應(yīng)適當延長保溫時間5~10min。堿性裂解法提取生物檢材DNA只需一個離心管，一次完成DNA的提取，雖然不能提取100%純度的DNA，但極大地避免了常規(guī)方法反復(fù)提純必然導(dǎo)致的DNA在量上的損失。因此，本方法對微量檢材DNA的提取有著更廣泛的應(yīng)用前景www.med126.com。
與Chelex-100提取法相比較，堿性裂解法有以下特點：耗時少，堿性裂解法提取檢材一般需5min。堿性裂解法提取DNA所耗檢材少，靈敏度高。堿性裂解法所需儀器及設(shè)備只是一個0.5ml小離心管，試劑只是NaOH及Tris-HCl等，這些均是普通實驗室常規(guī)材料及試劑，大大節(jié)約了資金，減少了對國外試劑及儀器的依賴。同時既適合普通的銀染檢測，又適用于自動DNA片段分析儀進行片段分析。由于所用試劑中含有強堿，可以有效抑制Taq酶抑制劑的作用，所以對于相同的位點，可以取得跟Chelex-100相似的擴增效果。
（四)改良方法
將Chelex-100法或堿性裂解法處理的血痕，用等體積的飽和酚-氯仿（1:1)處理一次，再用冰無水乙醇沉淀，揮干后，加適量無菌水溶解。這樣提取的DNA，經(jīng)過PCR擴增電泳后，顯示結(jié)果會更好。
二、STR基因座的PCR擴增及電泳檢測
方法同實驗二
【注意事項】
對于微量血痕的DNA樣本，往往需要在擴增反應(yīng)體系中加入更多的DNA模板，以提高擴增成功率。有時，可能需要進行多次擴增方能成功。
