(三)電鏡免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)的應(yīng)用
免疫電鏡在細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)水平應(yīng)用抗原與相應(yīng)抗體能特異性結(jié)合的原理,使用標(biāo)記抗體對(duì)細(xì)胞內(nèi)存在的抗原性物質(zhì)進(jìn)行定性、定位和定量觀察,是免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)在亞細(xì)胞水平的進(jìn)一步發(fā)展。
1.免疫電鏡標(biāo)本制備 腎臟組織的免疫電鏡標(biāo)本制備與一般透射電鏡標(biāo)本的制備有所不同,其具體步驟如下:
。1)固定與包埋:腎臟組織一般采用低濃度戊二醛為固定劑,而不使用鋨酸,以盡可能多地保存抗原活性,常使用甲醛-戊二醛固定液(甲醛4%,戊二醛0.05%~0.5%)。包埋劑常使用 Lowicryl K4M(丙烯酸酯類(lèi)化合物)或LRWhite 樹(shù)脂在-20~35℃低溫下包埋,以紫外線(xiàn)照射使之聚合。避免使用常規(guī)之環(huán)氧樹(shù)脂包埋,因環(huán)氧樹(shù)脂需加熱使之聚合,而使標(biāo)本之抗原活性下降。
。2)修塊、定位及切片:包埋后之組織塊經(jīng)初步修塊后,先在超薄切片機(jī)上用玻璃刀(勿用鉆石刀)切出一張0.5~1μm厚的半薄片,用1%鹼性復(fù)紅或美藍(lán)溶液進(jìn)行染色,在光鏡下觀察組織內(nèi)腎小球的數(shù)量及病變情況,挑選出一個(gè)病變最為典型的腎小球,作出標(biāo)記。然后在組織塊上定出相應(yīng)部位,用刀切去周?chē)M織,修成約0.1mm大小之組織塊,再用超薄切片機(jī)切出500 。A厚度的超薄切片。
。3)免疫標(biāo)記:目前應(yīng)用最多的是膠體金標(biāo)記抗體(詳見(jiàn)第七章 )。
2.免疫電鏡觀察 腎組織標(biāo)本皆采用包埋后染色,第一抗體為特異性抗血清(如兔抗人IgG),第二抗體為膠體金標(biāo)記之抗體(如豬抗兔IgG,金標(biāo)記Au10)。最后用枸椽酸鉛(或醋酸鉛)作對(duì)照染色,在透射電鏡下觀察。根據(jù)金顆粒的分布狀況,可作定位、定性及定量觀察,了解腎小球超微結(jié)構(gòu)成分的變化、探討腎臟疾病的病原及研究免疫復(fù)合物(沉積之電子致密物質(zhì))的組成成分等(詳見(jiàn)后)。
二、血清或腎臟洗脫液的檢查
腎臟疾病時(shí),血清學(xué)檢查亦甚為重要,現(xiàn)僅就與免疫細(xì)胞化學(xué)有關(guān)者介紹如下:
1.血清或腎臟洗脫液內(nèi)抗腎小球基底膜抗體的測(cè)定 在快速進(jìn)行性腎小球腎炎(RPGN)及Goodpasture綜合征病人血清中常存在有抗腎小球基底膜抗體,對(duì)病人血清進(jìn)行檢查有重要的診斷意義。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中,對(duì)馬杉氏腎炎等實(shí)驗(yàn)性腎小球腎炎動(dòng)物,進(jìn)行腎臟洗脫液的檢查,以確定有無(wú)抗腎小球基底膜抗體的存在。一般常用免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)進(jìn)行檢查,先將病人血清與靈長(zhǎng)類(lèi)(如猴等)的腎組織冰凍切片在37℃濕盒內(nèi)孵育半小時(shí),再將切片用FITC熒光素或HRP標(biāo)記的抗人Igg 抗體處理。如果病人血清中存在有抗腎小球基底膜抗體,即可與切片上的腎小球基底膜相結(jié)合,進(jìn)一步與熒光標(biāo)記抗人IgG抗體相反應(yīng),而顯示沿腎小球毛細(xì)血管壁呈連續(xù)線(xiàn)形之熒光分布(酶標(biāo)抗體亦顯示同樣之連續(xù)線(xiàn)形分布)。本方法又可用于與抗腎小管基底膜抗體和抗核抗體的鑒別。
2.血清中循環(huán)免疫復(fù)合物內(nèi)IgG亞類(lèi)的分析 以3%聚乙二醇(PEG)沉淀病人血清中大分子蛋白質(zhì),分別使用鼠抗人IgG亞類(lèi)IgG1、IgG2、IgG3、IgG4的單克隆抗體,以ELISA法測(cè)定免疫復(fù)合物內(nèi)IgG亞類(lèi)的分布狀況。以同樣方法亦可測(cè)定腎小球中沉積的免疫復(fù)合物內(nèi)的IgG亞類(lèi)。Noel 報(bào)道,不同腎炎時(shí)腎小球內(nèi)沉積之IgG亞類(lèi)有所不同。原發(fā)性膜性腎炎之沉積物為Igg 1和IgG4,狼瘡性腎炎之沉積物為IgG1、IgG2和IgG3。
3.血清中Tamm-Horsfall糖蛋白(THP)的測(cè)定 THP是由腎小管髓袢升支厚壁段及遠(yuǎn)曲小管上皮細(xì)胞合成的糖蛋白,主要存在于正常人的尿中,血清中含有微量。當(dāng)腎功能減退時(shí),血及尿中THP明顯降低,尿毒癥時(shí)則血及尿中幾乎測(cè)不出THP。目前可使用抗THP單克隆抗體,用ELISA夾心法測(cè)定血清中THP的含量。第一抗體使用鼠抗人THP單克隆抗體,第二抗體為HRP標(biāo)記的兔抗鼠IgG。
4.其它 血清中自身抗體如抗核抗體、抗雙鏈DNA抗體、抗Sm抗體等的測(cè)定,對(duì)狼瘡性腎炎有診斷意義?怪z點(diǎn)抗體的測(cè)定對(duì)進(jìn)行性系統(tǒng)性硬化(硬皮病)有診斷意義,以上測(cè)定皆使用免疫熒光法,具體操作不再贅述。