（二)培養(yǎng)細(xì)胞的原位雜交細(xì)胞化學(xué)方法
�。�1)固定：通常將細(xì)胞培養(yǎng)在蓋玻片或塑料薄膜上，可將蓋玻片取出，傾去培養(yǎng)液，用4%多聚甲醛液固定2～4h后，依組織切片處理法進(jìn)行ISHH實(shí)驗(yàn)。也有在4%多聚甲醛室溫固定20min后，由低濃度30%，50%，70%酒精各3min ，保留在新鮮配制的70%酒精中，4℃，備用。
�。�2)重回到水：50%，30%酒精3min，無菌重蒸水2×3min，然后置入PBS含5mmol/l MgCl2 10min，室溫（配制法：200ml PBS, 1ml MgCl2)。
�。�3)0.1mol/L甘氨酸/Tris pH7.4：室溫10min(0.1mol/L 甘氨酸，0.2mol/l Tris（配制法：1.5mg甘氨酸和20ml Tris，應(yīng)用重蒸水制成200ml)。
以后步驟同（一)組織切片法。
二、生物素標(biāo)記cRNA探針在原位雜交組織化學(xué)中的應(yīng)用
�。ㄒ�)光敏生物素標(biāo)記cRNA探針的應(yīng)用
以線性質(zhì)粒DNA為模板合成未加標(biāo)記物的cRNA探針，使其最終濃度為0.5～1.0μg/μl(500~1000ng/μl),再與等體積的光敏生物素（1μg/μl)混合。在150瓦鹵素?zé)粝�，距離光源20cm處照射30min。用仲丁醇抽提游離生物素，再用丁醇沉淀回收光敏生物素cRNA探針，將其溶于適量的滅菌雙蒸水，用紫外分光光度計(jì)測探針的光密度（詳?shù)谑耪隆?，其最佳工作濃度為2μg/ml。
切片的制作、預(yù)處理、預(yù)雜交、雜交和雜交后沖洗的方法同概述中基本方法一節(jié) 。
光敏生物素核酸探針原位雜交組化程序：
�。�1)石蠟切片脫蠟入水后，置0.1mol/l PBS pH7.2沖洗5min；冰凍切片直接入PBS沖洗5min。
�。�2)0.1mol/l 甘氨酸PBS沖洗5min。
�。�3)0.4%Trition X-100 PBS 沖洗15min。
（4)蛋白酶K1μg/ml（0.1mol/l Tris –HCl pH8.0, 50mmol/L EDTA配)37℃保溫30min。
�。�5)4%多聚甲醛PBS固定5min。
（6)0.1mol/l PBS沖洗2×3min。
�。�7)0.25%乙酸酐（0.1mol/l 三乙醇胺配制)10min。
�。�8)2×SSC沖洗10min（1×SSC：0.15mol/l NaCl, 0.015mol/L 檸檬酸鈉)。
�。�9)取10μl含相應(yīng)探針的雜交液滴于標(biāo)本上，如果是cDNA探針則用前將探針于95℃水浴中保溫10min，馬上放入冰浴中冷卻，然后再用。
（10)蓋上22×22mm的硅化蓋片或合適大小的蠟?zāi)�，入溫�?3℃保溫12～16h。
�。�11)4×SSC洗脫蓋片，并在同一液中37℃漂洗10～30min。
�。�12)2×SSC（含20μg/mlRNaseA, 適于RNA探針)沖洗30min，37℃。
�。�13)1×SSC，0.1×SSC,37℃各漂洗10～30min。
�。�14)0.05mol/l PBS 沖洗4×5min。
�。�15)3%BSA（0.4%Triton X-100 PBS配)37℃保溫30min。
�。�16)Avidin –AKP(堿性磷酸酶)（1：500～1：100，0.4%Triton X-100 PBS配)室溫1～3h。
�。�17)0.05mol/l PBS沖洗4×5min。
（18)TSM1沖洗2×5min。
�。�19)TSM2沖洗2×5min。
（20)硝基四氮唑藍(lán)（NBT)0.4%mg/ml 和5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸（BCIP)0.2mg/ml混合液顯色，室溫，暗處3h。
�。�21)20mmol/l EDTA,pH8.0終止顯色。
�。�22)甘油明膠直接封片。
結(jié)果：雜交陽性部位著藍(lán)黑色。
組織處理及預(yù)雜交所用器皿需高溫消毒，實(shí)驗(yàn)者需戴手套。
