實用免疫細胞與核酸:第三節(jié)　凝集素

凝集素（Lectin)是指一種從各種植物，無脊椎動物和高等動物中提純的糖蛋白或結合糖的蛋白，因其能凝集紅血球（含血型物質)，故名凝集素。其常見種類見表6-1。常用的為植物

表6—1 常見的凝集素一覽表

凝集素（Phytoagglutin, PNA)，通常以其被提取的植物命名，如刀豆素A（Conconvalina,ConA)、麥胚素（Wheat germ agglutinin, WGA)、花生凝集素（Peanutagglutinin, PNA)和大豆凝集素（Soybean agglutinin, SBA)等，凝集素是它們的總稱。凝集素不是來源或參與免疫反應的產(chǎn)物，它們之所以被收入本書，是由于凝集素具有的某些“親合”特性，能被免疫細胞化學技術方法所應用。因此，Ponder（1983)提出應稱“凝集素組織化學”而不能稱為“凝集素免疫組織化學”。

一、凝集素的特性

凝集素具有多方面的特性，在此我們僅簡要提及其與免疫細胞化學技術方法應用有關的某些特性。我們知道，生物膜中含有一定量的糖類，主要以糖蛋白和糖脂的形式存在。凝集素最大的特點在于它們能識別糖蛋白和糖肽中，特別是細胞膜中復雜的碳水化合物結構，即細胞膜表面的碳脂化合物決定簇。一種凝集素具有對某一種特異性糖基專一性結合的能力，如刀豆素與α—D—吡喃糖基甘露糖（α—D—Mannopyranosy)結合；麥芽素與N—乙酰糖胺（N—acetyl glucosamine)結合；菜豆凝集素與N—乙酰乳糖胺結合（見本章　表6—1)。 因此，凝集素可以作為一種探針來研究細胞膜上特定的糖基。另一方面，凝集素具有多價結合能力，能與熒光素、生物素、酶、膠體金和鐵蛋白等示蹤物結合，從而在光鏡與/或電鏡水平顯示其結合部位。

二、凝集素的應用

一般認為細胞膜上特定的糖基可用以區(qū)別細胞的類型和反映細胞在分化、成熟和腫瘤細胞性變中的變化。僅在某些特殊的例子，其細胞結合凝集素的性能可以預先估計，如雙花扁豆素之于血型A物質的特異性，荊豆凝集素之于血型O物質2—L—巖藻糖的特異性，然而在絕大多數(shù)情況下，關于由凝集素所識別的碳水化合物決定簇的種類，關于攜帶決定簇的分子的性質和機能，完全憑實驗經(jīng)驗去發(fā)現(xiàn)。

1．作為細胞分化和成熟的標記 　應用凝集素作為細胞分化的標志，在這方面的應用報告最多，而且研究比較集中于血細胞，特別是淋巴細胞的分群。如Rose（1980)等發(fā)現(xiàn)在小鼠胸腺皮質內不成熟的T淋巴細胞呈PNA陽性反應，在小鼠小腸集合淋巴小結的生發(fā)中心也發(fā)現(xiàn)有20%左右的PNA陽性反應細胞，后者是否屬于不成熟的T淋巴細胞，是值得進一步研究的問題。Newman等（1979)以熒光素標記凝集素PNA，發(fā)現(xiàn)在大鼠乳腺上皮的不同分化時期顯示不同的熒光強度。在不成熟的大鼠乳腺上皮細胞，熒光弱或無，隨著性成熟期到妊娠期乳腺上皮熒光程度逐漸加強，而泌乳期熒光強度達最高峰。在皮膚角質細胞自基底向表層分化、成熟的過程中，細胞表面的碳水化合物的分布和性質都在改變。Brabed等（1981)應用新生大鼠皮膚的實驗表明，皮膚各層細胞分別與不同的凝集素相結合。麥芽素與角質化細胞相結合，蓖麻素與棘細胞和基底細胞相結合，而荊豆凝集素標記在棘細胞的表面。在成肌細胞（myeoblast)的分化與成熟過程中，Winaod 和Luzzati（1975)注意到類似的皮膚的改變。

2．作為細胞特殊類型的標記　Kivela和Farkkanen（1987)發(fā)現(xiàn)在人視網(wǎng)膜，PNA標記視錐細胞而不標記視桿細胞。在乳腺、乳腺上皮細胞呈PNA陽性反應而肌上皮細胞和間質細胞呈PNA陰性反應。以多種凝集素對小鼠、大鼠和兔的腎組織切片進行染色結果表明，刀豆素A和蓖麻素存在于腎臟的各部，PNA和雙花扁豆凝集素（DBA)主要分布于遠曲小管和集合小管上皮細胞，荊豆凝集素（UEA)主要分布在血管內皮細胞，而麥芽素分布在腎小球。應用DBA對RIII和DDK品種的小鼠研究表明，DBA主要結合在各種組織內毛細血管內皮細胞上，電鏡觀察顯示DBA結合在內皮細胞的表面，在趣的是在RIII品系小鼠某些組織的內皮細胞顯示肯定的DBA陰性反應，說明同一種屬動物的血管內皮細胞也存在有組織特異性的差別。Streit和Kreutzberg（1987)發(fā)現(xiàn)GriffoniaSimplicifolia凝集素特異性標記面神經(jīng)節(jié)　內的小膠質細胞，其它類型的膠質細胞如星狀膠質細胞（astrocyte)等都顯示陰性反應。在切斷面神經(jīng)后，增殖的小膠質細胞對Griffonia Simplicifolia凝集素的反應加強，免疫電鏡觀察表明，凝集素主要沉積在細胞膜或小膠質細胞突起的軸膜表面，特異性結合糖基是α—D—半乳糖。上海醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院免疫病理zxtf.net.cn/hushi/室應用12種凝集素（表6-1)對人胚胎及各種正常組織進行了系統(tǒng)的凝集素受體的定位研究，結果表明，凝集素受體的分布并無即定規(guī)律可尋。如胃粘膜主細胞為PNA受體，而壁細胞為BSL受體，雙花扁豆受體（DBA)主要出現(xiàn)在大腸部份。

3．在腫瘤中凝集素結合的改變 　腫瘤細胞伴有細胞膜的改變，細胞膜上的糖基也會產(chǎn)生相應的變化，可用凝集素檢測出來。大量研究發(fā)現(xiàn)，凝集素可作為腫瘤組織源性的標記、腫瘤特異性診斷的標志、腫瘤惡性的標記和不同腫瘤的分化標記。如張華忠等（1987)報道115例胃癌標記PHA陽性率高達90.43%，而正常胃粘膜基本是陰性，故認為PHA是胃癌的診斷性標志。BSA對乳腺惡性腫瘤陽性率達79%，而對良性病變均呈陰性反應，提示BSA可能為乳腺惡性腫瘤的相關標志。凝集素還有助于判別腫瘤的組織類型，如神經(jīng)系統(tǒng)星形細胞瘤ConA陽性，小膠質細胞瘤陰性，腎腺癌UEA1陰性，透明細胞癌陽性。

三、凝集素在免疫細胞化學中的應用

凝集素可為熒光素、酶和生物素等所標記，分別進行下列染色法：

1．直接法　 標記物直接標記在凝集素上，使之直接與切片中的相應糖蛋白或糖脂相結合。

（1)切片脫蠟至水。

（2)凝集素標記物（100μg/ml)，室溫，30min。

（3)TBS洗3次，每次2min。

（4)如為熒光素標記物，封片用熒光顯微鏡觀察。如為酶標記物，則應依次進行呈色、脫水、透明和封固后在光學顯微下觀察。

直接法的優(yōu)點是簡便，目前商品用的凝集素藥盒已能購得。但靈敏性不夠高。

2．間接法 　將凝集素直接與切片中的相應糖基結合，而將標記物結合在抗凝集素抗體上。

（1)脫蠟至水。

（2)用含3%的H2O2的甲醇阻斷內源性過氧化物酶10min。

（3)凝集素稀釋液（100μg/ml)孵育30min。

（4)TBS洗3次，每次2min。

（5)用標記了的抗凝集素抗體（1：100)孵育30min。

（6)TBS洗3次，每次2min。

（7)呈色、脫水、透明、封片。

（8)觀察。

間接法染色還可進一步改良為：①三步法：即在凝集素孵育后，接著用抗凝集素抗體孵育，再用標記了的抗-抗凝集素抗體孵育，層層放大，進一步提高其敏感性，PAP復合物也可作為標記物標記在抗-抗凝集素抗體上。②抗生物素—生物素凝集素法：用結合了生物素的凝集素孵育切片后，TBS洗后再以抗生物素—標記物與之結合。間接法較直接法和直接法敏感性高5～10倍或更多一些，但必須購買或自制抗凝集素抗體。

3．糖—凝集素—糖法　本法是利用過量的凝集素與組織切片中特定的糖基相結合。經(jīng)沖洗后，凝集素上還存在未被占用的結合部位，將這些部位與有過氧化物酶標記的特異性糖基相結合，形成一個三明治樣的糖—凝集素—糖的結合物。

（1)脫蠟至水。

（2)用含3%的H2O2的甲醇阻斷內源性過氧化物酶10min。

（3)用100μg/ml的凝集素孵育30min。

（4)TBS洗3次，每次3min。

（5)用100μg/mlHRP標記的糖液孵育30min。

（6)TBS洗3次，每次3min。

（7)DAB呈色、脫水、透明、封固。

本法特異性強，靈敏度高，因為這不象生物素—抗生物素法那樣要改變凝集素，又不需要像抗體那樣要制備抗體。HRP本身含有甘露糖，能與刀豆凝集素A、扁豆凝集素和豌豆凝集素結合。但對其它的凝集素，本法目前普及還有一定困難，因為要將過氧化物酶結合到其它凝集素上，就需要將一個適當?shù)奶妓�化合物基團嵌入過氧化物酶，稱為糖基化（glycosylation)，方法雖不復雜（Lee 等1976)，但需一定的試劑和設備。商品化能提供的糖基化過氧化物酶品種尚有限。

【注意事項】

①凝集素需要重金屬離子維持其活躍的結合部位，如果金屬離子耗盡了，就會影響凝集素的結合能力。因此，有作者主張用TBS作為緩沖液，內加微量的金屬，配方是：Tris 60.57g,NaCl87g,H2O加至1000ml，其中含CaCl2、MgCl2各1.0mmol/L�；蛟谶M入凝集素孵育前，先用該液孵育，以增強凝集素結合力。

②和其它抗體血清應用一樣， 應用每批新的凝集素實驗時，都先要用緩沖液稀釋成不同等級；如8，16，32，64，125，250，500，1000μg/ml，經(jīng)染色選擇最佳稀釋度。

③有作者認為阻斷組織內源性過氧化物酶所用的H2O2對碳水化合物有影響，可能改變凝集素的結合形式，因此，應盡量少用或不用，我們及一些作者在實驗過程中發(fā)現(xiàn)影響不明顯。

④有作者認為凡經(jīng)固定的組織切片，不論是石蠟包埋切片或冰凍切片，都有可能使組織中抗原隱蔽，為了暴露隱蔽了的碳水化合物基團，主張在凝集素孵育前用酶處理切片，常用胰蛋白酶液（配制見附表)進行適當?shù)姆跤��?/p>

⑤已知哺乳動物的質膜含有占蛋白總量的1%～10%的碳水化合物，它們以低聚糖（oligosacchride)糖脂，并主要以糖蛋白的形式存在，糖蛋白線性的或分支的旁鏈可能含有兩個到多個單糖殘基，通常有兩種或更多的單糖，在單糖單位末端常常是一個帶負電荷的N-乙酰神經(jīng)氨酸的殘基，一個唾液酸（siallic acid)。有作者在凝集素實驗中常用神經(jīng)氨酸酶(neuramidinase)分解細胞表面的唾液酸或神經(jīng)氨酸，以暴露出隱蔽的能與聚集素結合的次終末的碳水化合物。配制方法是將神經(jīng)氨酸酶（Type V,Sigma Lot 63F—8172 63F--8172)用醋酸緩沖液（含2%牛血清白蛋白)BSA配成0.5μg/ml。

切片脫蠟后進行酶消化的過程中，將該組織切片置于上述配制液中，在濕盒內，37℃孵育30min。用緩沖液洗后，進行凝集素染色。

⑥對照試驗，和其它組化染色一樣，凝集素染色也需要設對照試驗（最好在相鄰切片進行)。由于凝集素具有單糖特異性，如果外加相應的糖，把凝集素的結合部位占有了，凝集素就不能再與組織中的糖基相結合了。一般采用的方法是將凝集素預先與相應的糖（0.2mol/L)在室溫孵育30min，使之占有凝集素結合部位，再將此液代替凝集素進行孵育，結果應為陰性。在某些情況下即使提高糖液的濃度也不能達到完全的抑制。這時，只有用與凝集素有高親合力的低聚糖（oligosachrides)代替或將切片預先用相應的糖苷酶孵育去除特異性糖基（Watanalte等，1981)。

四、HRP標記凝集素及凝集素抗體的制備

1．HRP標記凝集素法 適用于小量的凝集素標記（Ponder 1983)。

（1)HRP的活化

①將10mg HRP(SigmaType VI)溶解在1ml 0.3mol/L 的重碳酸鈉溶液中（1.25g/50ml)。

②加50μl含1%氟二硝基苯的無水乙醇溶液，室溫輕度攪拌1h。

③加1ml含0.06mol/L的過碘酸鈉的蒸餾水（0.62g/50ml)，室溫下輕度攪拌30min。

④在室溫下加兩滴0.16mol/L乙二醇，輕攪1h。

⑤用Sephadex G—25裝成小柱，用0.3mol/L的重碳酸鈉溶液，使含HRP的混合液過柱。

（2)結合

①正常條件下，可用凝集素及過氧化物酶各半量，但其比例可根據(jù)需要調整，以10mg凝集素溶解在25ml的重碳酸鹽緩沖液里，加到“活化”的HRP中去 ，這樣得出的凝集素濃度大約是0.3mg/ml，可加進0.1mol/L相應的特異的糖，以保護凝集素結合時的結合部位。糖在下步透析或層析時去掉。

②在室溫下輕攪拌，結合3h。

③加入1mg硼氫化鈉，室溫下作用1h以穩(wěn)定結合物活性。

④用1N HCl調整pH至6.4，留置室溫下過夜。

（3)純化

①用適當?shù)哪�膠層析柱如SephadexG—200、Saphacryl—300層析法將游離的凝集素、游離的過氧化物酶和高分子量的成分從結合物分離出去，包括抑制性的糖也在此時分離出去。

②提純后的結合物在280nm和403nm波長處測量其吸光率。用1%BSA先通過0.22μm的微孔過濾器，以確定被結合的凝集素是否被吸附在濾器中，然后上述結合物經(jīng)過該微孔濾過器過濾到一個無菌瓶中。

③加入疊氮鈉，濃度1：1000，保存于4℃C備用。

2．抗凝集素抗體的制備 　抗凝集素抗體的制備法與一般免疫血清制備大致相同（見第二章　)。所不同的是：①凝集素具有較強的毒性，易使被免疫動物發(fā)病或甚至死亡。解決的方法是經(jīng)處理使凝集素變性，從而減低其毒性，但同時要保證其抗原性不受或少受破壞。②要設法阻斷凝集素的糖結合部位，以減少對這些部位的抗體的產(chǎn)生，解決的辦法是預先以相應的糖阻斷這些結合部位。Leathem 和Atkin（1982)設計了一個辦法，他們首先應用瓊脂糖（Sepharose)珠，珠上有一系列共價糖的附著，這些糖可阻斷凝集素結合部位，這種糖珠有商品供應（Sigma LtD)，每1ml糖珠能結合大約12mg凝集素。其次用加入福爾馬林和加熱的方法使凝集素變性，毒性減低而不影響抗原性。具體操作如下：

①1ml瓊脂糖—半乳糖珠與1mg花生凝集素相結合，室溫1h。

②加入10ml 10%福爾馬林，在水浴中加熱到60℃，1h。

③用鹽水離心洗珠，將珠分成以10μl為單位的若干小份，保存在-20℃。

④皮下多處注射兩只家兔背部，每次注射100μl，每隔三周注射一次。取血40～50ml，保存在-20℃?zhèn)溆谩?/p>