流式細(xì)胞術(shù)（Flow Cytometry, FCM)是一種可以對(duì)細(xì)胞或亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)進(jìn)行快速測(cè)量的新型分析技術(shù)和分選技術(shù)。其特點(diǎn)是：①測(cè)量速度快，最快可在1秒種內(nèi)計(jì)測(cè)數(shù)萬(wàn)個(gè)細(xì)胞；②可進(jìn)行多參數(shù)測(cè)量，可以對(duì)同一個(gè)細(xì)胞做有關(guān)物理、化學(xué)特性的多參數(shù)測(cè)量，并具有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；③是一門(mén)綜合性的高科技方法，它綜合了激光技術(shù)、計(jì)算機(jī)技術(shù)、流體力學(xué)、細(xì)胞化學(xué)、圖像技術(shù)等從多領(lǐng)域的知識(shí)和成果；④既是細(xì)胞分析技術(shù)，又是精確的分選技術(shù)。
概要說(shuō)來(lái)，流式細(xì)胞術(shù)主要包括了樣品的液流技術(shù)、細(xì)胞的分選和計(jì)數(shù)技術(shù)，以及數(shù)據(jù)的采集和分析技術(shù)等。FCM目前發(fā)展的水平凝聚了半個(gè)世紀(jì)以來(lái)人們?cè)谶@方面的心血和成果。
1934年，Moldavan1首次提出了使懸浮的單個(gè)血紅細(xì)胞等流過(guò)玻璃毛細(xì)管，在亮視野下用顯微鏡進(jìn)行計(jì)數(shù)，并用光電記錄裝置計(jì)測(cè)的設(shè)想，在此之前，人們還習(xí)慣于測(cè)量靜止的細(xì)胞，因?yàn)橐箚蝹�(gè)細(xì)胞順次流過(guò)狹窄管道容易造成較大的細(xì)胞和細(xì)胞團(tuán)塊的淤阻。1953年Crosland www.med126.com–Taylor根據(jù)雷諾對(duì)牛頓流體在圓形管中流動(dòng)規(guī)律的研究認(rèn)識(shí)到：管中軸線(xiàn)流過(guò)的鞘液流速越快，載物通過(guò)的能力越強(qiáng)，并具有較強(qiáng)的流體動(dòng)力聚集作用。于是設(shè)計(jì)了一個(gè)流動(dòng)室，使待分析的細(xì)胞懸浮液都集聚在圓管軸線(xiàn)附近流過(guò)，外層包圍著鞘液；細(xì)胞懸浮液和鞘液都在作層液。這就奠定了現(xiàn)代流式細(xì)胞術(shù)中的液流技術(shù)基礎(chǔ)。
1956年，Coulter在多年研究的基礎(chǔ)上利用Coulter效應(yīng)生產(chǎn)了Coulter 計(jì)數(shù)器。其基本原理是：使細(xì)胞通過(guò)一個(gè)小孔，只在細(xì)胞與懸浮的介質(zhì)之間存在著導(dǎo)電性上的差異，便會(huì)影響小孔道的電阻特性，從而形成電脈沖信號(hào)，測(cè)量電脈沖的強(qiáng)度和個(gè)數(shù)則可獲得有關(guān)細(xì)胞大小和數(shù)目方面的信息。1967年Holm等設(shè)計(jì)了通過(guò)汞弧光燈激發(fā)熒光染色的細(xì)胞，再由光電檢測(cè)設(shè)備計(jì)數(shù)的裝置。1973年Steinkamp設(shè)計(jì)了一種利用激光激發(fā)雙色熒光色素標(biāo)記的細(xì)胞，既能分析計(jì)數(shù)，又能進(jìn)行細(xì)胞分選的裝置。這樣就基本完成了現(xiàn)代FCM計(jì)數(shù)技術(shù)的主要?dú)v程。
現(xiàn)代的FCM數(shù)據(jù)采集和分析技術(shù)是從組織化學(xué)發(fā)源的，其開(kāi)拓者是Kamentsky。1965年，Kamentsky在組織化學(xué)的基礎(chǔ)上提出了兩個(gè)新設(shè)想：（1)細(xì)胞的組分是可以用光光度學(xué)來(lái)定量測(cè)定的，即分光光度術(shù)可以定量地獲得有關(guān)細(xì)胞組織化學(xué)的重要信息。（2)細(xì)胞的不同組分可以同時(shí)進(jìn)行多參數(shù)測(cè)量，從而可以對(duì)細(xì)胞進(jìn)行分類(lèi)。換句話(huà)說(shuō)，對(duì)同一細(xì)胞可以同時(shí)獲得有關(guān)不同組分的多方面信息，用作鑒別細(xì)胞的依據(jù)。Kamentsky不僅思路敏捷，而且能身體力行。他是第一個(gè)把計(jì)算機(jī)接口接到儀器上并記錄分析了多參數(shù)數(shù)據(jù)的人，也是第一個(gè)采用了二維直方圖來(lái)顯示和分析多參數(shù)的人。
流式細(xì)胞術(shù)在細(xì)胞化學(xué)中的應(yīng)用的先驅(qū)者是Van Dilla和美國(guó)的Los Alamos小組。他們?cè)?967年研制出流液束、照明光軸、檢測(cè)系統(tǒng)光軸三者相互正交的流式細(xì)胞計(jì)的基礎(chǔ)上，首次用熒光Feulgen反應(yīng)對(duì)DNA染色顯示出DNA的活性與熒光之間存在著線(xiàn)性關(guān)系，并在DNA的直方圖上清楚地顯示出細(xì)胞周期的各個(gè)時(shí)相。Gohde 和Dittrich接著把這項(xiàng)技術(shù)推向?qū)嵱�，他們用流式�?xì)胞術(shù)測(cè)定細(xì)胞周期借以研究細(xì)胞藥代動(dòng)力學(xué)問(wèn)題。FCM用于免疫組織化學(xué)中的關(guān)鍵是對(duì)細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光染色，其它和在細(xì)胞化學(xué)的應(yīng)用并沒(méi)有多大差異。
近20年來(lái)，國(guó)內(nèi)外在FCM上都做了不少的研究和應(yīng)用工作，也取得了不少成果。特別是隨著儀器和方法和日臻完善，人們?cè)絹?lái)越致力于樣品制備、細(xì)胞標(biāo)記、軟件開(kāi)發(fā)等方面的工作以擴(kuò)大FCM的應(yīng)用領(lǐng)域和使用效果。FCM在免疫組織化學(xué)中的應(yīng)用也大致差不多，并注重了在臨床應(yīng)用的推廣。
流式細(xì)胞計(jì)是對(duì)細(xì)胞進(jìn)行自動(dòng)分析和分選的裝置。它可以快速測(cè)量、存貯、顯示懸浮在液體中的分散細(xì)胞的一系列重要的生物物理、生物化學(xué)方面的特征參量，并可以根據(jù)預(yù)選的參量范圍把指定的細(xì)胞亞群從中分選出來(lái)。多數(shù)流式細(xì)胞計(jì)是一種零分辨率的儀器，它只能測(cè)量一個(gè)細(xì)胞的諸如總核酸量，總蛋白量等指標(biāo)，而不能鑒別和測(cè)出某一特定部位的核酸或蛋白的多少。也就是說(shuō)，它的細(xì)節(jié) 分辨率為零。國(guó)外又把流式細(xì)胞計(jì)稱(chēng)作熒光激活細(xì)胞分選器（Flu－orescence Activated Cell Sorter, FACS)。美國(guó)Becton—Dickinson 公司生產(chǎn)的流式細(xì)胞計(jì)系列均冠以FACS字頭。目前我國(guó)國(guó)內(nèi)使用的儀器多為美國(guó)、西歐及日本等國(guó)的產(chǎn)品，國(guó)內(nèi)有些單位也已研制成功，但尚無(wú)定型產(chǎn)品面市。
1．流式細(xì)胞計(jì)的基本結(jié)構(gòu) 流式細(xì)胞計(jì)主要由四部分組成。它們是：流動(dòng)室和液流系統(tǒng)；激光源和光學(xué)系統(tǒng)；光電管和檢測(cè)系統(tǒng)；計(jì)算機(jī)和分析系統(tǒng)。圖10-1為其結(jié)構(gòu)示意圖。
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圖10-1 流式細(xì)胞計(jì)結(jié)構(gòu)示意圖
（1)流動(dòng)室和液流系統(tǒng)：流動(dòng)室由樣品管、鞘液管和噴嘴等組成，常用光學(xué)玻璃、石英等透明、穩(wěn)定的材料制作。設(shè)計(jì)和制作均很精細(xì)，是液流系統(tǒng)的心臟。樣品管貯放樣品，單個(gè)細(xì)胞懸液在液流壓力作用下從樣品管射出；鞘液由鞘液管從四周流向噴孔，包圍在樣品外周后從噴嘴射出。為了保證液流是穩(wěn)液，一般限制液流速度υ<10m/s。由于鞘液的作用，被檢測(cè)細(xì)胞被限制在液流的軸線(xiàn)上。流動(dòng)室上裝有壓電晶體，受到振蕩信號(hào)可發(fā)生振動(dòng)。
（2)激光源和光學(xué)系統(tǒng)：經(jīng)特異熒光染色的細(xì)胞需要合適的光源照射激發(fā)才能發(fā)出熒光供收集檢測(cè)。常用的光源有弧光燈和激光；激光器又以氬離子激光器為普遍，也有配和氪離子激光器或染料激光器。光源的選擇主要根據(jù)被激發(fā)物質(zhì)的激發(fā)光譜而定。汞燈是最常用的弧光燈，其發(fā)射光譜大部分集中于300～400nm，很適合需要用紫外光激發(fā)的場(chǎng)合。氬離子激光器的發(fā)射光譜中，綠光514nm和藍(lán)光488nm的譜線(xiàn)最強(qiáng)，約占總光強(qiáng)的80%；氪離子激光器光譜多集中在可見(jiàn)光部分，以647nm較強(qiáng)。免疫學(xué)上使用的一些熒光染料激發(fā)光波長(zhǎng)在550nm以上，可使用染料激光器。將有機(jī)染料做為激光器泵浦的一種成份，可使原激光器的光譜發(fā)生改變以適應(yīng)需要即構(gòu)成染料激光器。例如用氬離子激光器的綠光泵浦含有Rhodamine6G水溶液的染料激光器,則可得到550～650nm連續(xù)可調(diào)的激光，尤在590nm處轉(zhuǎn)換效率最高，約可占到一半。為使細(xì)胞得到均勻照射，并提高分辨率，照射到細(xì)胞上的激光光斑直徑應(yīng)和細(xì)胞直徑相近。因此需將激光光束經(jīng)透鏡會(huì)聚。光斑直徑d可由下式確定：d=4λf/πD。λ為激光波長(zhǎng)；f為透鏡焦距；D為激光束直徑。色散棱鏡用來(lái)選擇激光的波長(zhǎng)，調(diào)整反射鏡的角度使調(diào)諧到所需要的波長(zhǎng)λ。為了進(jìn)一步使檢測(cè)的發(fā)射熒光更強(qiáng)，并提高熒光訊號(hào)的信噪比，在光路中還使用了多種濾片。帶阻或帶通濾片是有選擇性地使某一濾長(zhǎng)區(qū)段的光線(xiàn)濾除或通過(guò)。例如使用525nm帶通濾片只允許FITC（Fluoresceinisothiocyanate,異硫氰熒光素)發(fā)射的525nm綠光通過(guò)。長(zhǎng)波通過(guò)二向色性反射鏡只允許某一波長(zhǎng)以上的光線(xiàn)通過(guò)而將此波長(zhǎng)以下的另一特定波長(zhǎng)的光線(xiàn)反射。在免疫分析中常要同時(shí)探測(cè)兩種以上的波長(zhǎng)的熒光信號(hào)，就采用二向色性反射鏡，或二向色性分光器，來(lái)有效地將各種熒光分開(kāi)。
（3)光電管和檢測(cè)系統(tǒng)：經(jīng)熒光染色的細(xì)胞受合適的光激發(fā)后所產(chǎn)生的熒光是通過(guò)光電轉(zhuǎn)換器轉(zhuǎn)變成電信號(hào)而進(jìn)行測(cè)量的。光電倍增管（PMT)最為常用。PMT的響應(yīng)時(shí)間短，僅為ns數(shù)量級(jí)；光譜響應(yīng)特性好，在200～900nm的光譜區(qū)，光量子產(chǎn)額都比較高。光電倍增管的增益從103到108可連續(xù)調(diào)節(jié) ，因此對(duì)弱光測(cè)量十分有利。光電管運(yùn)行時(shí)特別要注意穩(wěn)定性問(wèn)題，工作電壓要十分穩(wěn)定，工作電流及功率不能太大。一般功耗低于0.5W；最大陽(yáng)極電流在幾個(gè)毫安。此外要注意對(duì)光電管進(jìn)行暗適應(yīng)處理，并注意良好的磁屏蔽。在使用中還要注意安裝位置不同的PMT，因?yàn)楣庾V響應(yīng)特性不同，不宜互換。也有用硅光電二極管的，它在強(qiáng)光下穩(wěn)定性比PMT好。
從PMT輸出的電信號(hào)仍然較弱，需要經(jīng)過(guò)放大后才能輸入分析儀器。流式細(xì)胞計(jì)中一般備有兩類(lèi)放大器。一類(lèi)是輸出信號(hào)輻度與輸入信號(hào)成線(xiàn)性關(guān)系，稱(chēng)為線(xiàn)性放大器。線(xiàn)性放大器適用于在較小范圍內(nèi)變化的信號(hào)以及代表生物學(xué)線(xiàn)性過(guò)程的信號(hào)，例DNA測(cè)量等。另一類(lèi)是對(duì)數(shù)放大器，輸出信號(hào)和輸入信號(hào)之間成常用對(duì)數(shù)關(guān)系。在免疫學(xué)測(cè)量中常使用對(duì)數(shù)放大器。因?yàn)樵诿庖叻治鰰r(shí)常要同時(shí)顯示陰性、陽(yáng)性和強(qiáng)陽(yáng)性三個(gè)亞群，它們的熒光強(qiáng)度相差1～2個(gè)數(shù)量級(jí)；而且在多色免疫熒光測(cè)量中，用對(duì)數(shù)放大器采集數(shù)據(jù)易于解釋。此外還有調(diào)節(jié) 便利、細(xì)胞群體分布形狀不易受外界工作條件影響等優(yōu)點(diǎn)。
（4)計(jì)算機(jī)和分析系統(tǒng)：經(jīng)放大后的電信號(hào)被送往計(jì)算機(jī)分析器。多道的道數(shù)是和電信號(hào)的脈沖高度相對(duì)應(yīng)的，也是和光信號(hào)的強(qiáng)弱相關(guān)的。對(duì)應(yīng)道數(shù)年縱坐標(biāo)通常代表發(fā)出該信號(hào)的細(xì)胞相對(duì)數(shù)目。多道分析器出來(lái)的信號(hào)再經(jīng)模-數(shù)轉(zhuǎn)換器輸往微機(jī)處理器編成數(shù)據(jù)文件，或存貯于計(jì)算機(jī)的硬盤(pán)和軟盤(pán)上，或存于儀器內(nèi)以備調(diào)用。計(jì)算機(jī)的存貯容量較大，可存貯同一細(xì)胞的6～8個(gè)參數(shù)。存貯于計(jì)算機(jī)內(nèi)的數(shù)據(jù)可以在實(shí)測(cè)后脫機(jī)重現(xiàn)，進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析，最后給出結(jié)果。除上述四個(gè)主要部分外，還備有電源及壓縮氣體等附加裝置。
2．流式細(xì)胞計(jì)的工作原理 下面分別簡(jiǎn)要介紹流式細(xì)胞計(jì)有關(guān)的參數(shù)測(cè)量、樣品分選及數(shù)據(jù)處理等工作原理。
（1)參數(shù)測(cè)量原理：流式細(xì)胞計(jì)可同時(shí)進(jìn)行多參數(shù)測(cè)量，信息主要來(lái)自特異性熒光信號(hào)及非熒光散射信號(hào)。測(cè)量是在測(cè)量區(qū)進(jìn)行的，所謂測(cè)量區(qū)就是照射激光束和噴出噴孔的液流束垂直相交點(diǎn)。液流中央的單個(gè)細(xì)胞通過(guò)測(cè)量區(qū)時(shí)，受到激光照射會(huì)向立體角為2π的整個(gè)空間散射光線(xiàn)，散射光的波長(zhǎng)和入射光的波長(zhǎng)相同。散射光的強(qiáng)度及其空間分布與細(xì)胞的大小、形態(tài)、質(zhì)膜和細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，因?yàn)檫@些生物學(xué)參數(shù)又和細(xì)胞對(duì)光線(xiàn)的反射、折射等光學(xué)特性有關(guān)。未遭受任何損壞的細(xì)胞對(duì)光線(xiàn)都具有特征性的散射，因此可利用不同的散射光信號(hào)對(duì)不經(jīng)染色活細(xì)胞進(jìn)行分析和分選。經(jīng)過(guò)固定的和染色處理的細(xì)胞由于光學(xué)性質(zhì)的改變，其散射光信號(hào)當(dāng)然不同于活細(xì)胞。散射光不僅與作為散射中心的細(xì)胞的參數(shù)相關(guān)，還跟散射角、及收集散射光線(xiàn)的立體角等非生物因素有關(guān)。
在流式細(xì)胞術(shù)測(cè)量中，常用的是兩種散射方向的散射光測(cè)量：①前向角（即0。角)散射（FSC)；②側(cè)向散射（SSC)，又稱(chēng)90。角散射。這時(shí)所說(shuō)的角度zxtf.net.cn/yishi/指的是激光束照射方向與收集散射光信號(hào)的光電倍增管軸向方向之間大致所成的角度。一般說(shuō)來(lái)，前向角散射光的強(qiáng)度與細(xì)胞的大小有關(guān)，對(duì)同種細(xì)胞群體隨著細(xì)胞截面積的增大而增大；對(duì)球形活細(xì)胞經(jīng)實(shí)驗(yàn)表明在小立體角范圍內(nèi)基本上和截面積大小成線(xiàn)性關(guān)系；對(duì)于形狀復(fù)雜具有取向性的細(xì)胞則可能差異很大，尤其需要注意。側(cè)向散射光的測(cè)量主要用來(lái)獲取有關(guān)細(xì)胞內(nèi)部精細(xì)結(jié)構(gòu)的顆粒性質(zhì)的有關(guān)信息。側(cè)向散射光雖然也與細(xì)胞的形狀和大小有關(guān)，但它對(duì)細(xì)胞膜、胞質(zhì)、核膜的折射率更為敏感，也能對(duì)細(xì)胞質(zhì)內(nèi)較大顆粒給出靈敏反映。
在實(shí)際使用中，儀器首先要對(duì)光散射信號(hào)進(jìn)行測(cè)量。當(dāng)光散射分析與熒光探針聯(lián)合使用時(shí)，可鑒別出樣品中被染色和未被染色細(xì)胞。光散射測(cè)量最有效的用途是從非均一的群體中鑒別出某些亞群。
熒光信號(hào)主要包括兩部分：①自發(fā)熒光，即不經(jīng)熒光染色細(xì)胞內(nèi)部的熒光分子經(jīng)光照射后所發(fā)出的熒光；②特征熒光，即由細(xì)胞經(jīng)染色結(jié)合上的熒光染料受光照而發(fā)出的熒光，其熒光強(qiáng)度較弱，波長(zhǎng)也與照射激光不同。自發(fā)熒光信號(hào)為噪聲信號(hào)，在多數(shù)情況下會(huì)干擾對(duì)特異熒光信號(hào)的分辨和測(cè)量。在免疫細(xì)胞化學(xué)等測(cè)量中，對(duì)于結(jié)合水平不高的熒光抗體來(lái)說(shuō)，如何提高信噪比是個(gè)關(guān)鍵。一般說(shuō)來(lái)，細(xì)胞成分中能夠產(chǎn)生的自發(fā)熒光的分子（例核黃素、細(xì)胞色素等)的含量越高，自發(fā)熒光越強(qiáng)；培養(yǎng)細(xì)胞中死細(xì)胞/活細(xì)胞比例越高，自發(fā)熒光越強(qiáng)；細(xì)胞樣品中所含亮細(xì)胞的比例越高，自發(fā)熒光越強(qiáng)。
減少自發(fā)熒光干擾、提高信噪比的主要措施是：①盡量選用較亮的熒光染料；②選用適宜的激光和濾片光學(xué)系統(tǒng)；③采用電子補(bǔ)償電路，將自發(fā)熒光的本底貢獻(xiàn)予以補(bǔ)償。
（2)樣品分選原理：流式細(xì)胞計(jì)的分選功能是由細(xì)胞分選器來(lái)完成的�？偟倪^(guò)程是：由噴嘴射出的液柱被分割成一連串的小水滴，根據(jù)選定的某個(gè)參數(shù)由邏輯電路判明是否將被分選，而后由充電電路對(duì)選定細(xì)胞液滴充電，帶電液滴攜帶細(xì)胞通過(guò)靜電場(chǎng)而發(fā)生偏轉(zhuǎn)，落入收集器中；其它液體被當(dāng)作廢液抽吸掉，某些類(lèi)型的儀器也有采用捕獲管來(lái)進(jìn)行分選的。
穩(wěn)定的小液滴是由流動(dòng)室上的壓電晶體在幾十KHz的電信號(hào)作用下發(fā)生振動(dòng)而迫使液流均勻斷裂而形成的。一般液滴間距約距約數(shù)百μm。實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)公式f=v/4.5d給出形成穩(wěn)定水滴的振蕩信號(hào)頻率。其中v是液流速度，d為噴孔直徑。由此可知使用不同孔徑的噴孔及改變液流速度，可能會(huì)改變分選效果。使分選的含細(xì)胞液滴在靜電場(chǎng)中的偏轉(zhuǎn)是由充電電路和偏轉(zhuǎn)板共同完成的。充電電壓一般選+150V，或-150V；偏轉(zhuǎn)板間的電位差為數(shù)千伏。充電電路中的充電脈沖發(fā)生器是由邏輯電路控制的，因此從參數(shù)測(cè)定經(jīng)邏輯選擇再到脈沖充電需要一段延遲時(shí)間，一般為數(shù)十ms。精確測(cè)定延遲時(shí)間是決定分選質(zhì)量的關(guān)鍵，儀器多采用移位寄存器數(shù)字電路來(lái)產(chǎn)生延遲�？筛鶕�(jù)具體要求予以適當(dāng)調(diào)整。
（50)數(shù)據(jù)處理原理：FCM的數(shù)據(jù)處理主要包括數(shù)據(jù)的顯示和分析，至于對(duì)儀器給出的結(jié)果如何解釋則隨所要解決的具體問(wèn)題而定。
①數(shù)據(jù)顯示：FCM的數(shù)據(jù)顯示方式包括單參數(shù)直方圖（histogram)、二維點(diǎn)圖（dotplot)、二維等高圖（contour)、假三維圖（pseudo3D)和列表模式（listmode)等。
直方圖是一維數(shù)據(jù)用昨最多的圖形顯示形式，既可用于定性分析，又可用于定量分析，形同一般X—Y平面描圖儀給出的曲線(xiàn)。根據(jù)選擇放大器類(lèi)型不同，橫座標(biāo)可以是線(xiàn)性標(biāo)度或?qū)?shù)標(biāo)度，用“道數(shù)”（ChannelNo .)來(lái)表示,實(shí)質(zhì)上是所測(cè)的熒光或散射光的強(qiáng)度�？v座標(biāo)一般表示的是細(xì)胞的相對(duì)數(shù)。圖10-2給出的是直方圖形式。只能顯示一個(gè)參數(shù)與細(xì)胞之間的關(guān)系是它的局限性。
二維點(diǎn)圖能夠顯示兩個(gè)獨(dú)立參數(shù)與細(xì)胞相對(duì)數(shù)之間的關(guān)系。橫座標(biāo)和縱座標(biāo)分別為與細(xì)胞有關(guān)的兩個(gè)獨(dú)立參數(shù)，平面上每一個(gè)點(diǎn)表示同時(shí)具有相應(yīng)座標(biāo)植的細(xì)胞存在（圖10-3)�？梢杂啥S點(diǎn)圖得到兩個(gè)一維直方圖，但是由于兼并現(xiàn)象存在，二維點(diǎn)圖的信息量要大于二個(gè)一維直方圖的信息量。所謂兼并就是說(shuō)多個(gè)細(xì)胞具有相同的二維座標(biāo)在圖上只表現(xiàn)為一個(gè)點(diǎn)，這樣對(duì)細(xì)胞點(diǎn)密集的地方就難于顯示它的精細(xì)結(jié)構(gòu)。
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圖10-2 直方圖
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圖10-3 二維點(diǎn)圖
二維等高圖類(lèi)似于地圖上的等高線(xiàn)表示法。它是為了克服二維點(diǎn)圖的不足而設(shè)置的顯示方法。等高圖上每一條連續(xù)曲線(xiàn)上具有相同的細(xì)胞相對(duì)或絕對(duì)數(shù)，即“等高”。曲線(xiàn)層次越高所代表的細(xì)胞數(shù)愈多。一般層次所表示的細(xì)胞數(shù)間隔是相等的，因此等高線(xiàn)越密集則表示變化率越大，等高線(xiàn)越疏則表示變化平衡。圖10-4給出了二維等高圖的樣式。
假三維圖是利用計(jì)算機(jī)技術(shù)對(duì)二維等高圖的一種視覺(jué)直觀(guān)的表現(xiàn)方法。它把原二維圖中的隱座標(biāo)—細(xì)胞數(shù)同時(shí)顯現(xiàn)，但參數(shù)維圖可以通過(guò)旋轉(zhuǎn)、傾斜等操作，以便多方位的觀(guān)察“山峰”和“谷地”的結(jié)構(gòu)和細(xì)節(jié) ，這無(wú)疑是有助于對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析的。圖10-5為假三維圖的示意圖。
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圖10-4 二維等高圖
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圖10-5 假三維圖
列表模式其實(shí)只是多參數(shù)數(shù)據(jù)文件的一種計(jì)算機(jī)存貯方式，三個(gè)以上的參數(shù)數(shù)據(jù)顯示是用多個(gè)直方圖、二維圖和假三維圖來(lái)完成的。可用ListMode中的特殊技術(shù)，開(kāi)窗或用游標(biāo)調(diào)出相關(guān)部分再改變維數(shù)進(jìn)行顯示。例如，“一調(diào)二”就是在一維圖上調(diào)出二維圖來(lái)；“二調(diào)一”就是從二維圖中調(diào)出一維圖來(lái)。圖10-6給出了從二維圖等高圖中調(diào)出相應(yīng)窗口的直方圖的示意圖。
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圖10-6 從二維圖設(shè)窗調(diào)出直方圖示意
上面簡(jiǎn)要地介紹了幾種數(shù)據(jù)顯示形式，在實(shí)際應(yīng)用中，可根據(jù)需要選擇匹配，以便了解和獲得盡可能多的有用信息。
②數(shù)據(jù)分析：數(shù)據(jù)分析的方法總的可分為參數(shù)方法和非參數(shù)方法兩大類(lèi)。當(dāng)被檢測(cè)的生物學(xué)系統(tǒng)能夠用某種數(shù)學(xué)模型技術(shù)時(shí)則多使用參數(shù)方法。數(shù)學(xué)模型可以是一個(gè)方程或方程組，方程的參數(shù)產(chǎn)生所需要的信息來(lái)自所測(cè)的數(shù)據(jù)。例如在測(cè)定老鼠精子的DNA含量時(shí)，可以獲取細(xì)胞頻數(shù)的尖銳波形分布。如果采用正態(tài)分布函數(shù)來(lái)描述這些數(shù)據(jù)，則參數(shù)即為面積、平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差。方程的數(shù)據(jù)擬合則通常使用最小二乘法。而非參數(shù)分析法對(duì)測(cè)量得到的分布形狀不需要做任何假設(shè)，即采用無(wú)設(shè)定參數(shù)分析法。分析程序可以很簡(jiǎn)單，只需要直觀(guān)觀(guān)測(cè)頻數(shù)分布；也可能很復(fù)雜，要對(duì)兩個(gè)或多個(gè)直方圖逐道地進(jìn)行比較。
逐點(diǎn)描圖（或用手工，或用描圖儀、計(jì)算機(jī)系統(tǒng))是大家常用的數(shù)據(jù)分析的重要手段。我們�？梢杂脕�(lái)了解數(shù)據(jù)的特性、尋找那些不曾預(yù)料的特異征兆、選擇統(tǒng)計(jì)分析的模型、顯示最終結(jié)果等。事實(shí)上，不經(jīng)過(guò)先對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行直觀(guān)觀(guān)察分析就決不應(yīng)該對(duì)這批數(shù)據(jù)進(jìn)行數(shù)值分析。從這一點(diǎn)來(lái)看，非參數(shù)分析是參數(shù)分析的基礎(chǔ)。
逐道比較工作量較大，但用直觀(guān)法很容易發(fā)現(xiàn)明顯的差異，特別是對(duì)照組和測(cè)試組�？紤]到FCM的可靠性，要注意到對(duì)每組測(cè)量，都要有對(duì)照組，對(duì)照組可以是空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組、或零時(shí)刻對(duì)照組等，具體設(shè)置應(yīng)根據(jù)整體實(shí)驗(yàn)要求而定。對(duì)照組和測(cè)試組的逐道比較往往可以減少許多不必要的誤差和錯(cuò)誤解釋。順便指出，進(jìn)行比較時(shí)對(duì)曲線(xiàn)的總細(xì)胞數(shù)進(jìn)行歸一化處理，甚至對(duì)兩條曲線(xiàn)逐道相減而得到“差結(jié)果曲線(xiàn)”往往是適宜的。
因?yàn)閿?shù)據(jù)分析往往和結(jié)果解釋關(guān)系十分密切，也就是說(shuō)和生物學(xué)背景相關(guān)，因此具體的分析法和原理將在后面結(jié)合實(shí)例再介紹。
3．流式細(xì)胞計(jì)的技術(shù)參數(shù) 為了表征儀器性能，往往根據(jù)使用目的和要求而提出幾個(gè)技術(shù)參數(shù)或指標(biāo)來(lái)定量說(shuō)明。對(duì)于流式細(xì)胞計(jì)常用的技術(shù)指標(biāo)有熒光分辨率、熒光靈敏度、適用樣品濃度、分選純度、可分析測(cè)量參數(shù)等。
（1)熒光分辨率：強(qiáng)度一定的熒光在測(cè)量時(shí)是在一定道址上的一個(gè)正態(tài)分布的峰，熒光分辨率是指兩相鄰的峰可分辨的最小間隔。通常用變異系數(shù)（C.V值)來(lái)表示。C.V的定義式為：
C.V=σ/μ
式中，σ為標(biāo)準(zhǔn)偏差，μ是平均值。
在實(shí)際應(yīng)用中，我們使用挖關(guān)系式σ=0.423FWHM；其中FWHM為峰在峰高一半處的峰寬值。目前儀器的熒光分辨率均優(yōu)于2.0%。
（2)熒光靈敏度：反映儀器所能探測(cè)的最小熒光光強(qiáng)的大小。一般用熒光微球上所標(biāo)可測(cè)出的FITC（fluoresceinisothiocyanate 異硫氰基熒光素)的最少分子數(shù)來(lái)表示。目前儀器均可達(dá)到1000左右。
（3)分析速度/分選速度：儀器每秒種可分析/分選的數(shù)目。一般分析速度為5000～10000；分選速度掌握在1000以下。
（4)樣品濃度：主要給出儀器工作時(shí)樣品濃度的適用范圍。一般在105～107細(xì)胞/ml的數(shù)量級(jí)。
其它技術(shù)參數(shù)尚多，不再一一介紹。
4．流式細(xì)胞計(jì)的調(diào)試和使用 古語(yǔ)說(shuō)：“工欲善其事，必先利其器”。要想很好地應(yīng)用流式細(xì)胞分析和分選技術(shù)，必需先對(duì)儀器進(jìn)行調(diào)試，使其處于良好的工作狀態(tài)，并能正確使用儀器。下面簡(jiǎn)要介紹細(xì)胞計(jì)的調(diào)試項(xiàng)目及要點(diǎn)、使用的程序等等。
（1)調(diào)試和校準(zhǔn)：流式細(xì)胞計(jì)在使用前，甚至在使用過(guò)程中都要精心進(jìn)行調(diào)試，以保證工作的可靠性和最佳性。調(diào)試的項(xiàng)目主要是激光強(qiáng)度、液流速度和測(cè)量區(qū)的光路等。
激光強(qiáng)度：除調(diào)整反射鏡的角度以調(diào)整到所需波長(zhǎng)的激光出光外，還要結(jié)合顯示屏上的光譜曲線(xiàn)使激光的強(qiáng)度輸出為最大。
液流速度：可通過(guò)操作臺(tái)數(shù)字顯示監(jiān)督，調(diào)節(jié) 氣體壓力大小以獲得穩(wěn)定的液流速度。
測(cè)量區(qū)光路調(diào)節(jié)�。哼@是調(diào)試工作的關(guān)鍵。需要保證在測(cè)量區(qū)的液流、激光束、90。散射測(cè)量光電系統(tǒng)垂直正交，而且交點(diǎn)較小。一般可在用標(biāo)準(zhǔn)熒光微球等校準(zhǔn)中完成。
流式細(xì)胞術(shù)中所測(cè)得的量是相對(duì)值，因此需要在使用前或使用中對(duì)系統(tǒng)進(jìn)行校準(zhǔn)或標(biāo)定，這樣才能通過(guò)相對(duì)測(cè)量獲得絕對(duì)的意義。因而FCM中的校準(zhǔn)具有雙重功能：儀器的準(zhǔn)直調(diào)整和定量標(biāo)度。標(biāo)準(zhǔn)樣品應(yīng)該穩(wěn)定，有形成份形狀應(yīng)是大小比較一致球形，樣品分散性能良好，且經(jīng)濟(jì)、容易獲得。常用標(biāo)準(zhǔn)熒光微球作為非生物學(xué)標(biāo)準(zhǔn)樣品，雞血紅細(xì)胞做為生物學(xué)標(biāo)準(zhǔn)樣品。微球用樹(shù)脂材料制作，或標(biāo)有熒光素，或不標(biāo)記熒光素。FlowCytometry Stands公司可提供熒光強(qiáng)度藥盒，在免疫實(shí)驗(yàn)中可用來(lái)作為定量熒光標(biāo)準(zhǔn)來(lái)測(cè)定每個(gè)細(xì)胞所標(biāo)記的抗原位點(diǎn)數(shù)目。所用的雞血紅細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)樣品制作過(guò)程昭下：取3.8%枸櫞酸或肝素抗凝的雞血（抗凝劑：雞血=1：4)，經(jīng)PBS清洗3次，再用5～10ml的1.0%戊二醛與清洗后的雞紅細(xì)胞混合，室溫下振蕩醛化24h，最后經(jīng)PBS再清洗，貯4℃冰箱中備用。需要指出的是因?yàn)槲唇?jīng)熒光染色，所測(cè)光信號(hào)為雞血紅蛋白的自發(fā)熒光。
（2)儀器的操作和使用：
①打開(kāi)電源，對(duì)系統(tǒng)進(jìn)行預(yù)熱；
②打開(kāi)氣體閾，調(diào)節(jié) 壓力，獲得適宜的液流速度；開(kāi)啟光源冷卻系統(tǒng)；
③在樣品管中加入去離子水，沖洗液流的噴嘴系統(tǒng)；
④利用校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)樣品，調(diào)整儀器，使在激光功率、光電倍增管電壓、放大器電路增益調(diào)定的基礎(chǔ)上，0。和90。散射的熒光強(qiáng)度最強(qiáng)，并要求變異系數(shù)為最��；
⑤選定流速、測(cè)量細(xì)胞數(shù)、測(cè)量參數(shù)等，在同樣的工作條件下測(cè)量樣品和對(duì)照樣品；同時(shí)選擇計(jì)算機(jī)屏上數(shù)據(jù)的顯示方式，從而能直觀(guān)掌握測(cè)量進(jìn)程；
⑥樣品測(cè)量完畢后，再用去離子水沖洗液流系統(tǒng)；
⑦因?yàn)閷?shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)已存入計(jì)算機(jī)硬盤(pán)（有的機(jī)器還備有光盤(pán)系統(tǒng)，存貯量更大)，因此可關(guān)閉氣體、測(cè)量裝置，而單獨(dú)使用計(jì)算機(jī)進(jìn)行數(shù)據(jù)處理；
⑧將所需結(jié)果打印出來(lái)。
在操作和使用中一定要注意如下事項(xiàng)：
1)光電倍增管要求穩(wěn)定的工作條件，暴露的較強(qiáng)的光線(xiàn)下以后，需要較長(zhǎng)時(shí)間的“暗適應(yīng)”以消除或降低部分暗電流本底才能工作；另外還要注意磁屏蔽；
2)光源不得在短時(shí)間內(nèi)（一般要1h左右)關(guān)上又打開(kāi)；使用光源必須預(yù)熱并注意冷卻系統(tǒng)工作是否正常；
3)液流系統(tǒng)必需隨時(shí)保持液流暢通，避免氣泡栓塞，所使用的鞘流液使用前要經(jīng)過(guò)過(guò)濾、消毒；
4)注意根據(jù)測(cè)量對(duì)象的變換選用合適的濾片系統(tǒng)、放大器的類(lèi)型等；
5)特別強(qiáng)度每次測(cè)量都需要對(duì)照組。
本節(jié) 著重介紹了流式細(xì)胞計(jì)的基本結(jié)構(gòu)和工作原理、技術(shù)指標(biāo)及使用操作中的基本問(wèn)題。由于實(shí)際使用的儀器廠(chǎng)家、型號(hào)差別很大，不能一一介紹，可參照儀器使用說(shuō)明書(shū)使用。至于流式細(xì)胞術(shù)在生物醫(yī)學(xué)工程和免疫組織化學(xué)應(yīng)用中的一些具體技術(shù)途徑則在下節(jié) 詳細(xì)介紹
