實用免疫細(xì)胞與核酸:第三節(jié)　PCR操作范例及反應(yīng)體系的組成

一、PCR操作范例

在一個典型的PCR反應(yīng)體系中需加入：適宜的緩沖液、微量的模板DNA、4×dNTPs、耐熱性多聚酶、Mg²⁺和兩個合成的DNA引物。模板DNa 94℃變性1min，引物與模板40～60℃退火1min，72℃延伸2min。在首次循環(huán)前模板預(yù)變性3～5min；在末次循環(huán)后，樣品仍需繼續(xù)延伸3～5min以上，確保擴增的DNA為雙鏈DNA。為便于了解PCR反應(yīng)中各成份的組成，加入量和反應(yīng)條件，使人們以此為基礎(chǔ)，對不同的研究對象逐項改變來找到最佳反應(yīng)條件，特列舉Perkin Elmer Cetus公司Gene Amp DNA試劑盒提供的典型反應(yīng)條件供參考。

表22-1 PCR反應(yīng)混合液

擴增條件：94℃60s,37℃60s,72℃120s,共25～30個循環(huán)。

注：[1]反應(yīng)緩沖液[10×]含：100mmol/l Tris-HCl pH8.3(25℃),

15mmol/L KCl, 15mmol/L MgCl₂,

0.01%(W/V)明膠（Sigma G2500)

[2]酶儲存緩沖液（-20℃)含：50%甘油，100mmol/l KCl,

20mmol/L Tris-HCl ph8.0

0.1mmol/L EDTA, 1.0mmol/L DTT

200μg/ml明膠

0.5%吐溫20，0.5% Nonidet P40

[3][4]引物，1，2：擴增λ-噬菌體基因中500bp的片段

引物1序列：7131～7155（5’)-GATGAGTTCGTGTCCGTACAACTGG-(3’)

引物2序列：7606～7630（5’)-GGTTATCGAAATCAGCCACAGCGCC-(3’)

注意（3’)端有2個bp互補故易生成50bp的雙體

二、PCR反應(yīng)系統(tǒng)的組成

（一)PCR緩沖液（PCrBuffer)

用于PCR的標(biāo)準(zhǔn)緩沖液見PCR操作范例。于72℃時，反應(yīng)體系的pH值將下降1個單位，接近于7.2。二價陽離子的存在至關(guān)重要，影響PCR的特異性和產(chǎn)量。實驗表明，Mg²⁺優(yōu)于Mn²⁺，而Ca²⁺無任何作用。

1．Mg²⁺濃度Mg²⁺的最佳濃度為1.5mmol/L(當(dāng)各種dNTP濃度為200mmol/L時)，但并非對任何一種模板與引物的結(jié)合都是最佳的。首次使用靶序列和引物結(jié)合時，都要把Mg²⁺濃度調(diào)到最佳，其濃度變化范圍為1～10mmol/L。Mg²⁺過量易生成非特異性擴增產(chǎn)物，Mg²⁺不足易使產(chǎn)量降低。

樣品中存在的較高濃度的螯合劑如EDTA或高濃度帶負(fù)電荷的離子基團如磷酸根，會與Mg²⁺結(jié)合而降低Mg²⁺有效濃度。因此，用作模板的DNA應(yīng)溶于10mmol/l Tris-HCl(pH7.6)0.1mmol/L EDTA中。

dNTP含有磷酸根，其濃度變化將影響Mg²⁺的有效濃度。標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體系中4×dTNPs的總濃度為0.8mmol/L，低于1.5mmol/L的Mg²⁺濃度。因此，在高濃度DNA及dNTP條件時，必須相應(yīng)調(diào)整Mg²⁺的濃度。

2．Tris -HCl緩沖液在PCR中使用10～50mmol/L的Tris –HCl緩沖液，很少使用其他類型的緩沖液。Tris緩沖液是一種雙極化的離子緩沖液，pKa為8.3(20℃),△pKa為0.021/℃。因此，20mmol/l Tris pH8.3(20℃)時，在典型的熱循環(huán)條件下，真正的pH值在7.8～6.8之間。

3．KCl濃度K⁺濃度在50mmol/L 時能促進引物退火。但現(xiàn)在的研究表明，NaCl濃度在50mmol/L時，KCl濃度高于50mmol/L將會抑制Taq酶的活性，少加或不加KCl對PCR結(jié)果沒有太大影響。

4．明膠明膠和BSA或非離子型去垢劑具有穩(wěn)定酶的作用。一般用量為100μg/ml，但現(xiàn)在的研究表明，加或不加都能得到良好和PCR結(jié)果，影響不大。

5．二甲基亞砜（DMSO)在使用Klenow片段進行PCR時DMSO是有用的；加入10%DM－SO有利于減少DNA的二級結(jié)構(gòu)，使（G+C)%含量高的模板易于完全變性，在反應(yīng)體系中加入DMSO使PCR產(chǎn)物直接測序更易進行，但超過10%時會抑制Taq DNA聚合酶的活性，因此，大多數(shù)并不使用DMSO。

（二)四種脫氧三磷酸核苷酸（4×dNTPs)

在PCR反體系中dNTP終濃度高于50mmol/L會抑制Taq酶的活性，使用低濃度dNTP可以減少在非靶位置啟動和延伸時核苷酸錯誤摻入，高濃度dNTPs易產(chǎn)生錯誤摻入，而濃度太低，勢必降低反應(yīng)物的產(chǎn)量。PCR常用的濃度為50～200μmol/L，不能低于10～15μmol/L。四種dNTP的濃度應(yīng)相同，其中任何一種濃度偏高或偏低，都會誘導(dǎo)聚合酶的錯誤摻入，降低合成速度，過早終止反應(yīng)。

決定最低dNTP濃度的因素是靶序列DNA的長度和組成，例如，在100μl反應(yīng)體系中，4×dNTPs濃度若用20μmol/L，基本滿足合成2.6μg DNA或10pmol的400bp序列。50μmol/L的4×dNTPs可以合成6.6μgDNA,而200μmol/L足以合成25μg/DNA。

購自廠商的dNTP溶液一般均未調(diào)pH，應(yīng)用1mol/l NaOH將dNTP貯存液pH調(diào)至7.0，以保證反應(yīng)的pH值不低于7.1。市購的游離核苷酸凍干粉，溶解后要用NaOH中和，再用紫外分光光度計定量。

（三)引物的量

引物在PCR反應(yīng)中的濃度一般在0.1～1μmol/L之間。濃度過高易形成引物二聚體且產(chǎn)生非特異性產(chǎn)物。一般來說用低濃度引物經(jīng)濟、特異，但濃度過低，不足以完成30個循環(huán)的擴增反應(yīng)，則會降低PCR的產(chǎn)率。

（四)TaqDNA聚合酶的量

典型PCR反應(yīng)混合物中，所用酶濃度為2.5U/μl，常用范圍為1～4U/100μl。由于DNA模板的不同和引物不同，以及其它條件的差異，多聚酶的用量亦有差異，酶量過多會導(dǎo)致非特異產(chǎn)物的增加。

由于生產(chǎn)廠家所用兵配方、制造條件以及活性定義不同，不同廠商供應(yīng)的TaqDNA聚合酶性能也有所不同。

Cetus公司酶定義是：1個酶單位是指在以下分析條件下，于74℃，30min內(nèi)使10nmmol的dNTP摻入酸不溶性成分所需的酶。測定時間為10min，折算成30min摻入量。

分析條件為25nmol/L TAPS（三羥基-甲基-氨基丙烷磺酸鈉pH9.3,25℃),50mmol/l KCl, 2mmol/L MgCl₂,1mmol/L β-ME（巰基乙醇)，dATP、dTTP、dGTP各200mmol/L，dCTP為100mmol/L(由不標(biāo)記及α-³²P標(biāo)記混合)，12.μg變性鯡魚精子DNA，最終體積50μl。

（五)模板

單、雙鏈DNA或RNA都可以作為PCR的樣品。若起始材料是RNA，須先通過逆轉(zhuǎn)錄得到第一條cDNA。雖然PCR可以僅用極微量的樣品，甚至是來自單一細(xì)胞的DNA，但為了保證反應(yīng)的特異性，還應(yīng)用ng級的克隆DNA，μg水平的單拷貝染色體DNA或10⁴拷貝的待擴增片段作為起始材料，模板可以是粗品，但不能混有任何蛋白酶、核酸酶、Taq DNA聚合酶抑制劑以及能結(jié)合DNA的蛋白。

DNA的大小并不是關(guān)鍵的因素，但當(dāng)使用極高分子量的DNA（如基因組的DNA時)，如用超聲處理或用切點罕見的限制酶（如Sal₁和Not₁)先行消化，則擴增效果更好。閉環(huán)靶序列DNA的擴增效率略低于線狀DNA，因此，用質(zhì)粒作反應(yīng)模板時最好先將其線狀化。

模板靶序列的濃度因情況而異，往往非實驗人員所控制，實驗可按已知靶序列量逆減的方式（1ng,0.1ng,0.001ng等)，設(shè)置一組對照反應(yīng)，以檢測擴增反應(yīng)的靈敏度是否符合要求。

（六)石蠟油

PCR擴增時建議在混合物上面鋪一層石蠟油，減少PCR過程中尤其是變性時液體蒸發(fā)所造成的產(chǎn)物的丟失。研究表明，應(yīng)用石蠟油可使擴增產(chǎn)量增加5倍，可能與石蠟油維持熱恒定和整個反應(yīng)體系中鹽濃度有關(guān)。

三、電泳分析

在實際工作中常采用瓊脂糖凝膠電泳。一般情況下先在電泳緩沖液或凝膠中加1%溴化乙錠（EB)（每100ml加100μl)，然后將已經(jīng)制備好的1%～2%瓊脂糖凝膠（用電泳緩沖液配制)放入電泳槽內(nèi)，加入待測樣品10μl，同時用分子量標(biāo)準(zhǔn)品作標(biāo)記。瓊脂糖濃度應(yīng)按分離DNA片段的大小進行選擇，一般用1.5%～2%，電泳電壓75V，待樣品進行凝膠內(nèi)距膠末端1cm時，切斷電源，取出凝膠在紫外燈下直接觀察結(jié)果。

由于溴化乙錠可與雙鏈DNA形成結(jié)合物，在紫外燈下能發(fā)射熒光，使EB的熒光強度增強80～100倍，所以，電泳后凝膠在紫外燈下可直接觀察。一般肉眼觀察DNA量可達10ng，其熒光強度與DNA含量成正比。

DNA分子在凝膠中泳動速度決定于電荷效應(yīng)及分子效應(yīng)。前者由所帶凈電荷量決定，而后者與分子大小及構(gòu)型有關(guān)。按照DNA分子大小，其凝膠濃度可做不同的調(diào)整。有條件的實驗室也可用聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE)分析擴增的DNA片段。

表22-2 電泳檢測擴增結(jié)果，EB熒光顯色（254nm)

第四節(jié)　影響PCR的主要因素

PCR技術(shù)必須有人工合成的合理引物和提取的樣品DNA，然后才進行自動熱循環(huán)，最后進行產(chǎn)物鑒定與分析。引物設(shè)計與合成目前只能在少數(shù)技術(shù)力量較強的研究院、所進行，臨床應(yīng)用只需購買PCR檢測試劑盒就可開展工作，PCR自動熱循環(huán)中影響因素很多，對不同的DNA樣品，PCR反應(yīng)中各種成份加入量和溫度循環(huán)參數(shù)均不一致。現(xiàn)將幾種主要影響因素介紹如下。

一、溫度循環(huán)參數(shù)

在PCR自動熱循環(huán)中，最關(guān)鍵的因素是變性與退火的溫度。如操作范例所示，其變性、退火、延伸的條件是：94℃60s, 37℃60s, 72℃120s，共25～30個循環(huán)，擴增片段500bp。在這里，每一步的時間應(yīng)從反應(yīng)混合液達到所要求的溫度后開始計算。在自動熱循環(huán)儀內(nèi)由混合液原溫度變至所要求溫度的時間需要30～60s，這一遲滯時間的長短取決于幾個因素，包括反應(yīng)管類型、壁厚、反應(yīng)混合液體積、熱源（水浴或加熱塊)以及兩步驟間的溫度差，在設(shè)置熱循環(huán)時應(yīng)充分給以重視和考慮，對每一儀器均應(yīng)進行實測。

關(guān)于熱循環(huán)時間的另一個重要考慮是兩條引物之間的距離；距離越遠，合成靶序列全長所需的時間也越長，前文給出的反應(yīng)時間是按最適于合成長度500bp的靶序列擬定的。下面就各種溫度的選擇作一介紹。

1．模板變性溫度變性溫度是決定PCR反應(yīng)中雙鏈DNA解鏈的溫度，達不到變性溫度就不會產(chǎn)生單鏈DNA模板，PCR也就不會啟動。變性溫度低則變性不完全，DNA雙鏈會很快復(fù)性，因而減少產(chǎn)量。一般取90～95℃。樣品一旦到達此溫度宜迅速冷卻到退火溫度。DNA變性只需要幾秒種，時間過久沒有必要；反之，在高溫時間應(yīng)盡量縮短，以保持Taq DNA聚合酶的活力，加入Taq DNA聚合酶后最高變性溫度不宜超過95℃。

2．引物退火溫度退火溫度決定PCR特異性與產(chǎn)量；溫度高特異性強，但過高則引物不能與模板牢固結(jié)合，DNA擴增效率下降；溫度低產(chǎn)量高，但過低可造成引物與模板錯配，非特異性產(chǎn)物增加。一般先由37℃反應(yīng)條件開始，設(shè)置一系列對照反應(yīng)，以確定某一特定反應(yīng)的最適退火溫度。也可根據(jù)引物的（G+C)%含量進行推測，把握試驗的起始點，一般試驗中退火溫度Ta(annealing temperature)比擴增引物的融解溫度TTm(meltingtemperature)低5℃，可按公式進行計算：

Ta = Tm -5℃= 4(G+C)+ 2(A+T)-5℃

其中A，T，G，C分別表示相應(yīng)堿基的個數(shù)。例如，20個堿基的引物，如果（G+C)%含量為50%時，則Ta的起點可設(shè)在55℃。在典型的引物濃度時（如0.2μmol/L),退火反應(yīng)數(shù)秒即可完成，長時間退火沒有必要。

3．引物延伸溫度溫度的選擇取決于Taq DNA聚合酶的最適溫度。一般取70～75℃，在72℃時酶催化核苷酸的標(biāo)準(zhǔn)速率可達35～100個核苷酸/秒。每分鐘可延伸1kb的長度，其速度取決于緩沖溶液的組成、pH值、鹽濃度與DNA模板的性質(zhì)。擴增片段如短于150bp，則可省略延伸這一步，而成為雙溫循環(huán)，因Taq DNA聚合酶在退火溫度下足以完成短序列的合成。對于100～300bp之間的短序列片段，采用快速、簡便的雙溫循環(huán)是行之有效的。此時，引物延伸溫度與退火溫度相同。對于1kb以上的DNA片段，可根據(jù)片段長度將延伸時間控制在1～7min，與此同時，在PCR緩沖液中需加入明膠或BSA試劑，使Taq DNA聚合酶在長時間內(nèi)保持良好的活性與穩(wěn)定性；15%～20%的甘油有助于擴增2.5kb左右或較長DNA片段。

4．循環(huán)次數(shù)常規(guī)PCR一般為25～40個周期。一般的錯誤是循環(huán)次數(shù)過多，非特異性背景嚴(yán)重，復(fù)雜度增加。當(dāng)然循環(huán)反應(yīng)的次數(shù)太少，則產(chǎn)率偏低。所以，在保證產(chǎn)物得率前提下，應(yīng)盡量減少循環(huán)次數(shù)。

擴增結(jié)束后，樣品冷卻并置4℃保存。

二、引物引物設(shè)計

要擴增模板DNA，首先要設(shè)計兩條寡核苷酸引物，所謂引物，實際上就是兩段與待擴增靶DNA序列互補的寡核苷酸片段，兩引物間距離決定擴增片段的長度，兩引物的5’端決定擴增產(chǎn)物的兩個5’末端位置。由此可見，引物是決定PCR擴增片段長度、位置和結(jié)果的關(guān)鍵，引物設(shè)計也就更為重要。

引物設(shè)計的必要條件是與引物互補的靶DNA序列必須是已知的，兩引物之間的序列未必清楚，這兩段已知序列一般為15～20個堿基，可以用DNA合成儀合成與其對應(yīng)互補的二條引物，除此之外，引物設(shè)計一般遵循的原則包括：

1．引物長度根據(jù)統(tǒng)計學(xué)計算，長約17個堿基的寡核苷酸序列在人的基因組中可能出現(xiàn)的機率的為1次。因此，引物長度一般最低不少于16個核苷酸，而最高不超過30個核苷酸，最佳長度為20～24個核苷酸。這樣短的寡核苷酸在聚合反應(yīng)溫度（通過72℃)下不會形成穩(wěn)定的雜合體。有時可在5’端添加不與模板互補的序列，如限制性酶切位點或啟動因子等，以完成基因克隆和其他特殊需要；引物5’端生物素標(biāo)記或熒光標(biāo)記可用于微生物檢測等各種目的。

有時引物不起作用，理由不明，可移動位置來解決。

2．（G+C)%含量引物的組成應(yīng)均勻，盡量避免含有相同的堿基多聚體。兩個引物中（G+C)%含量應(yīng)盡量相似，在已知擴增片段（G+C)%含量時宜接近于待擴增片段，一般以40%～60%為佳。

3．引物內(nèi)部應(yīng)避免內(nèi)部形成明顯的次級結(jié)構(gòu)，尤其是發(fā)夾結(jié)構(gòu)（hairpinstructures)。例如：

4．引物之間兩個引物之間不應(yīng)發(fā)生互補，特別是在引物3’端，即使無法避免，其3’端互補堿基也不應(yīng)大于2個堿基，否則易生成“引物二聚體”或“引物二倍體”（Primer dimer)。所謂引物二聚體實質(zhì)上是在DNA聚合酶作用下，一條引物在另一條引物序列上進行延伸所形成的與二條引物長度相近的雙鏈DNA片段，是PCR常見的副產(chǎn)品，有時甚至成為主要產(chǎn)物。

另外，兩條引物之間避免有同源序列，尤為連續(xù)6個以上相同堿基的寡核苷酸片段，否則兩條引物會相互競爭模板的同一位點；同樣，引物與待擴增靶DNA或樣品DNA的其它序列也不能存在6個以上堿基的同源序列。否則，引物就會與其它位點結(jié)合，使特異擴增減少，非特異擴增增加。

5．引物3’端配對DNA聚合酶是在引物3’端添加單核苷酸，所以，引物3’端5～6個堿基與靶DNA的配對要求必須精確和嚴(yán)格，這樣才能保證PCR有效擴增。

引物設(shè)計是否合理可用PCRDESN軟件和美國PRIMER軟件進行計算機檢索來核定。

人工合成的寡核苷酸引于最好經(jīng)過色譜（層析)純化或PAGE純化，以除去未能合成至全長的短鏈等雜質(zhì)。純化引物在25%乙腈溶液中4℃保存可阻止微生物的生長；一般情況下，不用的引物應(yīng)保存在-20℃冰箱中，在液體中引物能保存6個月，凍干后可保存1～2年。

三、DNA聚合酶

早在1956年Kornberg等就從大腸桿菌提取液中發(fā)現(xiàn)了DNA聚合酶，并且得到了DNA聚合酶Ⅰ純品。DNA聚合酶Ⅰ是由分子量為109000的一條多肽鏈構(gòu)成，此酶可被枯草桿菌蛋白酶分解為兩個片段，一個片段分子量為76000，有聚合酶活性，并有3’→5外切酶活力，即Klenow片段（Klenow fragment)。另一個片段分子量為34000，具有5’→’3’外切酶活力。因此，DNA聚合酶具有幾種功能：一是聚合作用，以DNA為模板，將dNTP中的脫氧單核苷酸逐個加到3-OH末端。二是有’3’→5’外切酶活力，能識別和消除錯配的引物末端，與復(fù)制過程中校正功能有關(guān)。三是5’→3’外切酶活力，它能從5’端水解核苷酸，還能經(jīng)過幾個核苷酸起作用，切除錯配的核苷酸。1985年Mullis 等發(fā)明了PCR方法，以Klenow片段完成β-珠蛋白的PCR后，世界上許多實驗室就考慮用耐熱DNA聚合酶代替Klenow片段進行PCR，使耐熱多聚酶的研究得以迅速發(fā)展。人們從生活于60℃（B.Stearothermophilus)到87℃（S.Solfatavicus)的許多菌中分離純化出耐熱DNA聚合酶，但有些酶不能耐受DNA變性所需溫度，所以無法應(yīng)用于PCR。現(xiàn)就PCR反應(yīng)中常用的DNA聚合酶等作一詳細(xì)介紹。

1．Taq DNA聚合酶用Taq DNA聚合酶代替大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段是使PCR普及應(yīng)用的關(guān)鍵。Klenow片段不能耐受95℃的雙鏈DNA變性溫度，所以每次循環(huán)都要加入新酶；而Taq DNA聚合酶可以耐受93～95℃的高溫，避免了不斷補加多聚酶的繁瑣操作，同時使退火和延伸溫度得以提高，減少了非特異性產(chǎn)物和DNA二級結(jié)構(gòu)對PCR的干擾，增進了PCR特異性、產(chǎn)量和敏感度，二者相比，其主要區(qū)別在于：①Klenow酶的最適溫度為37℃，擴增的產(chǎn)物并非全是目的序列，需用探針檢測。Taq酶則不僅產(chǎn)率高而特異性也高。它的最適溫度為74～75℃。因而使退火溫度可以提高，使退火嚴(yán)格性提高，減少錯配引物的延伸。②循環(huán)后期酶量漸感不足而產(chǎn)生平坡。到達平玻的循環(huán)次數(shù)，Klenow酶為20個（均用1μg基因組DNA開始)而Taq酶為30個。③延伸片段長度Taq酶為10kb以內(nèi)，而Klenow酶為400bp以內(nèi)。

Taq酶由水棲高溫菌（Thermusaquatics)YT1蓖株中分離而得。此菌于1969年由Brock分離自美國黃石公園溫泉，作為棲熱桿菌的標(biāo)準(zhǔn)菌株，其生長溫度為70～75℃。最初從中分離到分子量60～68KDa，比活性為2000～8000U/mg的DNA聚合酶。后來Cetus公司的Kary Mullis等又分離到比活為20萬U/mg的純酶，分子量為93910。此種9.4KDa酶的最適溫度為75～80℃，與單純核苷酸的結(jié)合率（Kcat)可達150核苷酸（nt)/s酶分子。以M₁₃模板，用富含G+C的30bp引物延伸，70℃時Kact>60nt/s；55℃可達24nt/s；37℃時為1.5nt/s，而22℃時低至0.25nt/s。高于90℃時DNA合成活性甚差，這種高溫條件下，引物與模板已不能牢固結(jié)合。

在PCR反應(yīng)混合液中，Taq酶于92.5℃,95℃及97.5℃保持其50%活力的時間分別為130、40及5～6min，在50次循環(huán)的PCR中當(dāng)管內(nèi)最高溫度為95℃。每循環(huán)為20s時尚可保持65%活力。Taq 酶在95℃的半壽期為40min，故在PCR循環(huán)中選用的變性溫度，不宜高于95℃。

Taq酶現(xiàn)已可用基因重組的方法生產(chǎn)，商品名為Ampli Taq（Cetus公司)。Taq酶的完整基因長2499bp，在大腸桿菌中表達生產(chǎn)，含832個氨基酸。在氨基酸序列上與大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ有38%是一致的，包括對dNTP結(jié)合，引物與模板作用區(qū)均存在于Taq酶中。

Taq酶具有依賴DNA合成的5’→’3’外切酶活性，因此，模板上有一段退火的3’-磷酸化的“阻斷物”，會被逐個切除而不會阻止來自上游引物鏈的延伸，而對于5’-³²P標(biāo)記的合成寡核苷酸引物，則無論是單鏈或是與模板復(fù)性，都未發(fā)現(xiàn)降解，所以該種活性不會影響PCR結(jié)果。Taq酶沒有3’→’5’外切酶活性，如果發(fā)生dNTP錯誤摻入，這種酶沒有校正能力，因此運用Taq酶進行PCR，產(chǎn)物中點突變較多，對克隆等不太有利。一般錯摻率為1.25×10^-4~1×10^-5(4×dNTPs濃度分別為200μmol/L，Mg²⁺為1.5mmol/L，在55℃退火)。但不含3’→5’外切酶活性對測序有利。

2．影響酶活力的因素Taq酶的活力受Mg²⁺離子的影響。用鯡精DNA為模板，總dNTP濃度0.7～0.8mmol/L,Mg²⁺為2.0mmol/L時激活能力最高。濃度超過此值產(chǎn)生抑制。10mmol/l MgCl₂抑制活力達40%～50%。dNTP能與Mg²⁺結(jié)合，故游離Mg²⁺只是結(jié)合后剩余的量。若總dNTP濃度高至4～6zxtf.net.cn/shiti/mmol/L時,Taq酶活力要降低20～30%，即底物抑制。

dNTP濃度低時PCR產(chǎn)率及特異性均增高，適合于用擴增摻入法標(biāo)記生物素及放射性元素。當(dāng)100μl　PCR液中含dNTP各zxtf.net.cn/job/40μmol/L時就足以合成2.6μg的DNA（dNTP消耗一半)。

表22-3 有機溶劑對Taq聚合酶活力的影響

用鯡精DNA，70℃，10min內(nèi)dNTP的摻入量計算，標(biāo)準(zhǔn)條件為100%。

純9.4KDa Taq酶不含3’→5’核酸外切酶活力。誤摻入率取決于dNTP濃度。但Taq酶具有DNA依賴的鏈移位5’→3’核酸外切酶活力。對5’→3’³²P標(biāo)記寡核苷酸單鏈，或與MB模板雜交時均只有極少的降解力。

中等濃度KCl能刺激Taq酶合成活力達50%～60%，最佳KCl濃度為50mmol/L，濃度更高有抑制作用，>200mmol/L的KCl可使酶失活。

加入50mmol/L NH₄Cl或NH₄Ac或NaCl,可產(chǎn)生中度抑制或無作用。

低濃度尿素、DMSO、DMF或甲酰胺影響不大，吐溫20/NP40可消除SDS（0.01%及0.1%)的抑制作用。

3．第二代耐熱DNA聚合酶Stoffel片段：Cetus公司的Stoffel將TaqDNA聚合酶的5’→3’外切酶活性片段（N端289個氨基酸)去除，稱為stoffel片段。其97.5℃的半衰期從Taq DNA聚合酶的5～6min提高到20min，同時該酶片段也對兩個或更多模板位點的擴增反應(yīng)即復(fù)合PCR（Multiplex PCR)更為有利。

Vent^TMDNA多聚酶：是美國New England Biolabs公司從潛水艇排氣孔（Vent)中分離的超級嗜熱菌-能生長于98℃中的Thermococcus litoralis中分離純化得到的，故名Vent酶。它的一些酶學(xué)性質(zhì)較Taq DNA聚合酶更為優(yōu)越，它能耐100℃高溫且2h以上仍有活力，并且具有3’→5’外切酶活性的校正能力，錯誤擴增的機率比Taq酶降低一倍。后來該公司又從深水潛艇（2010m)排氣孔分離的能在104℃生長的Pyococcus菌GB-D株植入Deep Vent DNA聚合酶基因而表達的Deep Vent DNA聚合酶，在95℃的半壽期達23h（Vent酶為6.7h,Taq酶為1h)。

4．RTth逆轉(zhuǎn)錄酶（rTth Reverse Transcriptase)目前逆轉(zhuǎn)錄-PCR（RT-PCR)的發(fā)展很快，所以對耐熱的依賴于RNA的DNA多聚酶的研究也有進展。有實驗表明Taq DNA多聚酶有依賴于RNA的DNA聚合酶活性，但活性較弱。Cetus公司于1991年推出一種rTth Reverse Tran－scriptase,有很好的依賴于RNA的耐熱DNA聚合酶活性和依賴于DNA的耐熱DNA聚合酶活性，二種活性分別依賴于Mn²⁺Mg²⁺，這樣就可分別控制酶活性。利用該酶只需250ng的總RNA即可有效地進行RT-PCR，得到特異的DNA片段，從而非常有利于逆轉(zhuǎn)錄PCR的發(fā)展。

耐熱DNA聚合酶的研究近幾年來得到長足的發(fā)展，這在PCR發(fā)展中起到了重要的作用。我們相信隨著進一步的研究，將使人們對耐熱DNA聚合酶的認(rèn)識和應(yīng)用更進一步地發(fā)展。

我國的PCR研究發(fā)展很快，其關(guān)鍵試劑-耐熱DNA聚合酶-也已有幾個實驗室能夠分離純化，如復(fù)旦大學(xué)遺傳學(xué)研究所、華美公司、中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所。后二者的菌株為Thermus aquaticus YT-1。前者則是從自己篩選的嗜熱菌中分離純化，復(fù)旦大學(xué)遺傳所亦已成功地克隆了該聚合酶的基因并獲得了耐熱F₄DNA聚合酶，其酶學(xué)性質(zhì)非常接近于Taq DNA聚合酶，為我國PCR的開展提供了保證。

四、影響PCR特異性的因素

通過上述內(nèi)容。可以看出有許多因素可以影響PCR的特異性，在此我們作一歸納，供大家參考：①退火步驟的嚴(yán)格性：提高退火溫度可以減少不匹配的雜交，從而提高特異性。②減短退火時間及延伸時間可以減少錯誤引發(fā)及錯誤延伸。③引物二聚體是最常見的副產(chǎn)品，降低引物及酶的濃度也可以減少錯誤引發(fā)，尤其是引物的二聚化。④改變MgCl₂(有時KCl)濃度可以改進特異性，這可能是提高反應(yīng)嚴(yán)格性或者對Taq酶的直接作用。⑤模板中如果存在次級結(jié)構(gòu)，例如待擴增的片段易自行形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)時，可在PCR混合物中的4×dNTPs中加入7-脫氮-2’-脫氧鳥苷-5’-三磷酸（7-deaza-2’-deoxyguanosine-5’-trihosphate)(de⁷GTP)。用de⁷GTP與dGTP比例為3：1的混合物（150μmol/l de⁷GTP +50μmol/L dGTP)代替200μmol/l dGTP，則可阻非特異性產(chǎn)物的生成。

五、擴增平坡

擴增反應(yīng)并不是可以無窮地進行下去的，經(jīng)過一定的循環(huán)周期后需擴增的片段不再按指數(shù)增多而逐漸進入平坡；進入平坡的循環(huán)次數(shù)，取決于起始時存在的模板拷貝數(shù)以及合成的DNA總量。所謂平坡就是批PCR循環(huán)的后期，合成產(chǎn)物達0.3～1pmol時，由于產(chǎn)物的堆積，使原來以指數(shù)增加的速率變成平坦的曲線。

造成PCR進入平坡的原因有：引物和dNTP等消耗完畢、Taq酶失活，這幾中因素在標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)中均不會出現(xiàn)。此外，還有幾種可能：

1．底物過剩因DNA合成量多于反應(yīng)液中存在的Taq酶，在100μl反應(yīng)液中含2.5Utaq酶而DNA合成量達1μg（3nmol脫氧核苷酸)時，開始變?yōu)榈孜镞^剩。延長延伸時間或添加Taq酶，可以克服之。但不實用，因每進行下一循環(huán)就要延長延伸時間一倍及多加一倍Taq酶，才能繼續(xù)保持指數(shù)增長。

2．非特異性擴增產(chǎn)物的競爭與上述情況密切相關(guān)，此時不需要的DNA片段與需要的片段同時競爭聚合酶，要克服這一情況是要提高反應(yīng)特異性，使不需要片段不能大量積聚。

3．退火時產(chǎn)物的單鏈自己締合兩條單鏈的DNA片段在退火時除了與引物締合外，也可以自行締合，這也會阻止產(chǎn)品增多。當(dāng)產(chǎn)物濃度到達10pmol/100μl時即可發(fā)生此現(xiàn)象，除稀釋外無法克服。

4．變性在高濃度產(chǎn)物條件下，產(chǎn)物解鏈不完全，以及最終產(chǎn)物的阻化作用（焦磷酸化，雙鏈DNA)。

總而言之，PCR的條件是隨系統(tǒng)的而異的，并無統(tǒng)一的最佳條件，先選用通用的條件擴增，然后稍稍改變各參數(shù)，可以達到優(yōu)化，以取得優(yōu)良的特異性和產(chǎn)率。