人巨噬細(xì)胞可從外周血或經(jīng)斑蝥激發(fā)的皮皰液中獲取,也可從肺灌洗液或患者腹膜透析液中分離,但操作繁鎖,得量不多。許多實(shí)驗(yàn)室在進(jìn)行基礎(chǔ)或配合臨床研究巨噬細(xì)胞功能及其與疾病的關(guān)系、或篩檢免疫增強(qiáng)藥物和探討其作用機(jī)制時,常選用小鼠腹腔巨噬細(xì)胞為研究對象,常用的檢測方法如下。
(一)炭粒廓清試驗(yàn)
正常小鼠肝中枯否細(xì)胞可吞噬清除90%炭粒,脾巨噬細(xì)胞約吞噬清除10%炭粒,據(jù)此給小鼠定量靜脈注射印度墨汁(炭粒懸液),間隔一定時間反復(fù)取靜脈血,測定血中炭粒的濃度,根據(jù)血流中炭粒被廓清的速度,判斷巨噬細(xì)胞的功能。
(二)吞噬功能的檢測
巨噬細(xì)胞具有較強(qiáng)的吞噬功能,實(shí)驗(yàn)室常用比細(xì)菌大的細(xì)胞性抗原作為被吞噬顆粒,如雞紅細(xì)胞。其檢測原理是將受檢細(xì)胞與適量的顆?乖旌虾,置37℃保溫0.5~1h,其間時加振搖,最后離心取測定細(xì)胞制成涂片,染色鏡檢,分別計數(shù)出吞噬百分比和吞噬指數(shù)。各實(shí)驗(yàn)室應(yīng)根據(jù)自己的條件建立正常參考值。
(三)巨噬細(xì)胞溶酶體酶的測定
zxtf.net.cn/kuaiji/巨噬細(xì)胞富含溶酶體酶,如酸性磷酸酶、非特異性酯酶、溶菌酶等,測定這些酶的活性也是衡量巨噬細(xì)胞功能的實(shí)用指標(biāo)之一。
1.酸磷酸酶的測定
(1)硝酸鉛法:本法優(yōu)點(diǎn)是用普通試劑,價格便宜,一般實(shí)驗(yàn)室均有條件做,封片后可較長時間保存,并可用電子顯微鏡研究觀察細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)。缺點(diǎn)是細(xì)胞必需固定,而且固定條件要求嚴(yán)格,如處理不當(dāng)酶活性易消失,反應(yīng)步驟也較多。
該法基本原理是在適當(dāng)?shù)拿感詶l件下,巨噬細(xì)胞內(nèi)的酸性磷酸酶能使β甘油磷酸鈉水解成磷酸鹽后,后者與硝酸鉛反應(yīng)產(chǎn)生磷酸鉛,而磷酸鉛再與硫酸銨反應(yīng)則形成黑色硫化鉛,沉積在胞漿內(nèi)酸所在處,顯示棕黑色顆粒。酶活性強(qiáng)弱可根據(jù)顆粒的數(shù)量和粗細(xì)不同而分級判斷,顆粒數(shù)量少則細(xì)的為+,顆粒多而粗的為++,顆粒很多且很粗的為+++。
(2)偶氮法:本法操作簡便,反應(yīng)液中的底物α-萘磷酸鈉被酸性磷酸酶分解后,形成萘酚和磷酸鹽,而萘酚結(jié)構(gòu)中的羥基(-OH)鄰近的活潑碳原子,立即與偶氮染料起反應(yīng),而產(chǎn)生鮮艷的棕色沉積在酶所在處,缺點(diǎn)是封片后保存時間短。
2.非特異性酶的測定該酶比較穩(wěn)定,酶活性喪失較慢,細(xì)胞經(jīng)涂片干燥,置室溫至少可保存半天至一天,因此特別有利于臨床檢驗(yàn)室采用。
常用α-萘醋酸法,該酶可將-萘醋酸分解成萘酚和醋酸,萘酚迅速與偶染料結(jié)合,形成有色反應(yīng)物而沉積。
(四)巨噬細(xì)胞促凝血活性測定
激活巨噬細(xì)胞可產(chǎn)生一種與膜結(jié)合的凝血活性因子,加速正常血漿的凝固,為此取已經(jīng)37℃預(yù)溫的正常兔血漿和CaC12混合液,加入經(jīng)粘附單層巨噬細(xì)胞的試管中,移置37℃,即時記錄血漿凝固時間。實(shí)驗(yàn)證明當(dāng)巨噬細(xì)胞與LPS、腫瘤相關(guān)抗原或HbsAg等溫育后,可見血漿凝固時間明顯縮短。本法穩(wěn)定方便,也是檢測不同疾病患者巨噬細(xì)胞功能的指標(biāo)之一。
(五)巨噬細(xì)zxtf.net.cn胞表面受體的檢測
成熟的巨噬細(xì)胞表面具有Fc受體和C3b受體,這些受體能識別經(jīng)IgG和C3b調(diào)理的顆粒,并迅速與之結(jié)合,促使細(xì)胞對相應(yīng)顆粒的吞噬,為此檢測這些受體可間接判斷巨噬細(xì)胞的功能。常用抗羊紅細(xì)胞致敏的羊紅細(xì)胞懸液作指示物進(jìn)行EA花環(huán)試驗(yàn),也可用抗原(E)抗體(A)補(bǔ)體(C)復(fù)合物作EAC花環(huán)試驗(yàn)。由于操作繁鎖,現(xiàn)僅供研究用。