動(dòng)脈粥樣硬化:第三節(jié)　載脂蛋白B基因多態(tài)性的檢測

ApoB是富含膽固醇和甘油三酯脂蛋白的重要組成成分，對脂質(zhì)在人體轉(zhuǎn)運(yùn)、代謝、維持體內(nèi)脂質(zhì)水平的恒定zxtf.net.cn/zhicheng/起重要作用。大量臨床資料及流行病學(xué)調(diào)查表明：血清ApoB及低密度脂蛋白（LDL)水平與動(dòng)脈粥樣硬化呈正相關(guān)，是其主要危險(xiǎn)因素之一。近十年來，從分子水平研究ApoB，闡明動(dòng)脈粥樣硬化及高脂血癥的發(fā)病機(jī)理，尋找其遺傳標(biāo)志受到廣泛重視，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)：ApoB基因具有明顯的多態(tài)性，其核苷酸變異有75處，其中導(dǎo)致氨基酸變異的有54處，例如多種酶限制性片段長度多態(tài)性（RFLP_s)，3’端高變區(qū)的數(shù)目可變的串聯(lián)重復(fù)順序（VNTR)，信號(hào)肽（SP)多態(tài)性。大量研究表明，ApoB的基因多態(tài)性與動(dòng)脈粥樣硬化有不同程度的關(guān)系。

一、分析ApoB基因多態(tài)性的方法

對ApoB基因多態(tài)性進(jìn)行檢測、分析的方法很多，如：限制性內(nèi)切酶的酶譜分析法，PCR直接分析法，PCR產(chǎn)物RFLP分析法，等位基因特異性寡核苷酸（ASO)雜交法等等，其中最多用且簡單的方法有PCR產(chǎn)物直接分析法和PCR產(chǎn)物RFLP分析法。

PCR產(chǎn)物直接分析法，是采用合適的引物，通過多次擴(kuò)增，獲得靶基因序列擴(kuò)增片段，直接分析法片段的大小，可用于分析基因的缺失與插入。這種方法簡便、快速、靈敏，可分析ApoB基因VNTR、SP多態(tài)性。

基因突變往往會(huì)造成限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)的改變，如位點(diǎn)丟失或產(chǎn)生新位點(diǎn)，通過PCR擴(kuò)增某一特定片段，再用限制性內(nèi)切酶酶切擴(kuò)增產(chǎn)物，電泳觀察片段的大小，這種方法用于檢測酶切位點(diǎn)改變的基因突變，可直接判斷基因型，是研究ApoB基因PFLP_s的較好方法，具有靈敏、簡便、可同時(shí)對大量樣品進(jìn)行分析等優(yōu)點(diǎn)。

二、ApoB基因多態(tài)性的檢測

ApoB基因多態(tài)性研究較多的有RFLP、VNTR、SP多態(tài)性，分別敘述如下：

1．RFLP的檢測

ApoB有10種RFLP，一般采用PCR-RPLPs方法進(jìn)行分析，研究較多的有第26外顯子XbaⅠ、MspⅠ位點(diǎn)，第29外顯子EcoRⅠ位點(diǎn)，在Apob DNA上的位置如圖19-6，圖19-7所示：

圖19-6 ApoB基因部分RFLP_S示意圖

圖19-6 ApoB基因多態(tài)性位置示意圖

用于PCR的引物如下：

XbaⅠ-5’GGAGACTATTCAGAAGCTAA

XbaⅠ-3’GAAGAGCCTGAAGACTGACT

EcoRⅠ-5’zxtf.net.cn/jianyan/CTGAGAGAAGTGTCTTCGAAG

EcoRⅠ-3’CTCGAAAGGAAGTGTAATCAC

MspⅠ-5’TCTCGGGAATATTCAGGAACTATTG

MspⅠ-3’CTAAGGATCCTACAATGTCAAGGT

XbaⅠ酶切位點(diǎn)的RFLP是由于2488位密碼子第三個(gè)堿基突變（ACC→ACT)，產(chǎn)生一個(gè)XbaⅠ酶切位點(diǎn)，但并未改變所編碼的氨基酸序列，存在XbaⅠ酶切位點(diǎn)（X⁺)的等位基因，其PCR產(chǎn)物酶切后出現(xiàn)433bp和277bp兩個(gè)片段，不存在XbaⅠ酶切位點(diǎn)（X^-)的等位基因，PCR產(chǎn)物經(jīng)酶切后仍為其產(chǎn)物710bp片段。

RFLP是由于4154位密碼子改變（GAA→AAA)，使原有的EcoRⅠ酶切位點(diǎn)消失，氨基酸序列中賴氨酸取代谷氨酸，存在EcoRⅠ酶切位點(diǎn)（R⁺)的等位基因，其PCR產(chǎn)物經(jīng)EcoRⅠ酶切后得到253bp及227bp兩個(gè)片段，不存在EcoRⅠ酶切位點(diǎn)（R^-)的等位基因，其PCR產(chǎn)物酶切后仍為480bp的片段。

MspⅠ酶切位點(diǎn)的RFLP，是由于3611位密碼子改變（CGG→CAG)，谷氨酰胺取代了精氨酸，含MspⅠ酶切位點(diǎn)（M⁺)的等位基因，PCR產(chǎn)物經(jīng)MspⅠ酶切后可見到395bp和85bp的片段，不含MspⅠ酶切位點(diǎn)（M^-)的等位基因，PCR產(chǎn)物酶切后仍為480bp。

眾多學(xué)者對ApoB基因RFLP_s與動(dòng)脈粥樣硬化之間的關(guān)系進(jìn)行了研究。多數(shù)學(xué)者認(rèn)為ApoE有XbaⅠ酶切位點(diǎn)（X⁺)，無EcoRⅠ酶切位點(diǎn)（E^-)，無MspⅠ酶切位點(diǎn)（M^-)的基因頻率，在動(dòng)脈粥樣硬化性疾病的患者中比正常對照組高，但也有學(xué)者持不同甚至相反意見，究其原因，可能有以下幾點(diǎn)：①研究樣品例數(shù)不夠，有的少于100個(gè)甚至少于50個(gè)，可能使一些有意義的聯(lián)系被忽略；②對照組的選擇沒有統(tǒng)一的、嚴(yán)格的、明確的標(biāo)準(zhǔn)，有時(shí)與病員組缺乏可比性；③存在種族差異，例如XbaⅠRFLP基因頻率，X⁺等位基因在高加索人為0.4～0.5,日本人和中國人則僅為0.04、0.01；④某些遺傳標(biāo)記之間可能存在連鎖關(guān)系，可導(dǎo)致結(jié)論互不相同。

2．VNTR的檢測

VNTR（數(shù)目可變的串聯(lián)重復(fù)順序)是繼RFLP_s之后的又一類具有高度多態(tài)性的遺傳標(biāo)記，廣泛分布于人類基因組中。ApoB基因3’端高變區(qū)（HVR)包含VNTR，由富含AT的DNA序列組成，其多態(tài)性特點(diǎn)是由10～15bp的核苷酸序列構(gòu)成不同的等位基因，產(chǎn)生不同的重復(fù)序列拷貝數(shù)。以VNTR兩側(cè)特異性序列為引物，經(jīng)PCR擴(kuò)增后直接電泳分析產(chǎn)物，片段之間的差異在于AT重復(fù)次數(shù)不同，重復(fù)37次稱為3β"37。依此類推，PCR引物可用以下序列：

VNTR-5’ATGGAAACGGAGAAATTATG

VNTR-3’CCTTCTCACTTGGCAAATAC

Boerwinkle等首先檢測出12種等位基因片段，現(xiàn)有學(xué)者已檢出22種不同等位基因。Frield等的研究發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)生38、44、46或48個(gè)15bp長度重復(fù)序列的等位基因與冠心病、血漿膽固醇水平升高有關(guān)，且與EcoRi RFLP呈連鎖不平衡，與MspⅠRFLP呈連鎖平衡，Robinson等的研究則沒有發(fā)現(xiàn)ApoB的VNTR多態(tài)性與血漿膽固醇、甘油三酯、ApoB等水平有關(guān)。

3．信號(hào)肽（SP)多態(tài)性的檢測

ApoB基因5’信號(hào)肽（SP)由27個(gè)（插入型Ins)或24個(gè)（缺失型Del)氨基酸組成，可經(jīng)PCR擴(kuò)增后直接分析，用于PCR的引物序列為：

IN/DE-5’CAGCTGGCGATGGACCCGCCGA

IN/DE-3’ACCGGCCCTGGCGCCCGCCAGCA

Wu等報(bào)告del/del基因型在高膽固醇血癥患者中比對照組中多見。Renges等對倫敦地區(qū)亞洲后裔的研究也發(fā)現(xiàn)帶del基因型者血漿總膽固醇升高，但與冠心病無明顯關(guān)系。Peacock等提出Ins/del多態(tài)性與冠心病的發(fā)展，即其嚴(yán)重程度有關(guān)，也有報(bào)道Ins/del多態(tài)性在冠心病與對照組中無明顯差別。

三、ApoB基因多態(tài)性檢測方法舉例

以ApoB基因第26個(gè)外顯子MspⅠ RFLP為例，具體介紹檢測的方法和步驟，筆者對湖北地區(qū)健康成人（120例)進(jìn)行了檢測。

（一)材料

引物（如前所述)，TaqDNA聚合酶、dNTP、限制性內(nèi)切酶MspⅠ、高速離心機(jī)、基因擴(kuò)增儀、恒溫水浴箱、電泳系統(tǒng)、紫外監(jiān)測儀。

（二)方法

1.模板DNA的提取

可采用改良的TritonX-100法提取人白細(xì)胞DNA，此法結(jié)果穩(wěn)定，但操作較繁瑣，在此采用改進(jìn)的Na裂解法提取人白細(xì)胞DNA，簡便、快速、靈敏、經(jīng)濟(jì)，步驟如下：

取EDTAN_a2抗凝血100μl，15000r/min離心5min，棄上層血漿，加無菌雙蒸水200μl，搖勻20s，加6mNaI200μl，搖勻20s，再加入氯仿/異戊醇（24/1)400μl，搖勻后15000r/min離心12min，小心吸取上層水相，移入另一離心管，加0.6倍體積的異丙醇，混勻后4℃放置15min，15000r/min離心12min，棄異丙醇，加入70%乙醇洗滌2～3次，室溫干燥，加入5μlTE緩沖液（pH=8.0)溶解DNA12～24h，4℃?zhèn)溆谩?/p>

2．模板DNA的擴(kuò)增

采用聚合酶鏈反應(yīng)（PCR)。反應(yīng)總體積50μl，MgCl₂終濃度為1.5mmol/L的1×Buffer,dNTp 0.2mmol/l，引物各20pmol,模板DNA約1.0μg，混勻，短暫離心，95℃預(yù)變性10min，加入Taq酶1.5U，液體石蠟50μl，短暫離心，按94℃ 45sec，60℃ 45sec,72℃1mim 15s循環(huán)30次，72℃延伸5min，置4℃貯存。

3．?dāng)U增產(chǎn)物的提純及酶切

取擴(kuò)增產(chǎn)物20μl，加入醋酸銨至2.5mol/L,與無水乙醇混勻，4℃沉淀15min，12000r/min離心10min，棄上清，70%乙醇漂洗兩次，室溫干燥后加入含Mspi 10U的緩沖液37℃保溫2h，加入EDTA至10mmol/L終止反應(yīng)。

4．?dāng)U增及酶切產(chǎn)物的檢測

（1)瓊脂糖電泳：制備2%瓊脂糖（含0.5μg/ml EB)，將擴(kuò)增產(chǎn)物與標(biāo)準(zhǔn)DNA（PGEM3zf（+)/HaeⅢ)點(diǎn)樣，電壓4v/cm，電泳，紫外燈下觀察。

（2)聚丙烯酰胺凝膠電泳：將擴(kuò)增及酶切產(chǎn)物加樣于8%聚丙烯酰胺凝膠上，電壓6V/cm，電泳4h，EB染色，紫外燈下觀察。

（3)結(jié)果：擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖電泳，紫外燈下呈一條強(qiáng)熒光帶，與已知DNa Marker相比較，約位于480bp的位置，與設(shè)計(jì)相符。

擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)MspⅠ酶切后，在8%PAGE上，可見到三種類型：①原始帶消失，出現(xiàn)兩條新帶，長度為395bp和85bp，為含酶切位點(diǎn)的M⁺M⁺純合子；②酶切后除與擴(kuò)增產(chǎn)物相同位置的原始帶外，還有兩條長度為395bp和85bp的帶，共三條帶，為M⁺M^-雜合子；③酶切后僅有一條帶，與擴(kuò)增產(chǎn)物位置相同，為無酶切位點(diǎn)的M^-M^-純合子。

以上三種基因型，以含酶切位點(diǎn)的純合型（M⁺M⁺)最多見，120例中有114例，不含酶切位點(diǎn)的M^-M^-型最少見，僅有1例，雜合型（M⁺M^-)有5例，根據(jù)基因頻率計(jì)算方法，等位基因M⁺頻率為0.97，少見等位基因M^-頻率為0.03。

若對冠心病患者同時(shí)進(jìn)行檢測，計(jì)算基因頻率，可見到：少見等位基因M^-在冠心病組比健康對照組高，有顯著性差異，但無論在冠心病組還是健康對照組，各基因型個(gè)體間的血脂、脂蛋白、載脂蛋白水平均無顯著性差異，這說明Apob MspⅠ多態(tài)性與冠心病有關(guān)，但與血中脂類水平的關(guān)系不明顯，這可能是由于環(huán)境因素，激素及其他遺傳因素對脂質(zhì)水平的影響較明顯，掩蓋了Apob MspⅠRFLP對脂質(zhì)的影響，也可能是這種多態(tài)性與ApoB基因上其他位點(diǎn)的多態(tài)性有連鎖關(guān)系。另外，由于少見等位基因M^-的頻率很低，有必要加大樣本例數(shù)，進(jìn)行進(jìn)一步的研究。