ApoB是富含膽固醇和甘油三酯脂蛋白的重要組成成分,對(duì)脂質(zhì)在人體轉(zhuǎn)運(yùn)、代謝、維持體內(nèi)脂質(zhì)水平的恒定zxtf.net.cn/zhicheng/起重要作用。大量臨床資料及流行病學(xué)調(diào)查表明:血清ApoB及低密度脂蛋白(LDL)水平與動(dòng)脈粥樣硬化呈正相關(guān),是其主要危險(xiǎn)因素之一。近十年來(lái),從分子水平研究ApoB,闡明動(dòng)脈粥樣硬化及高脂血癥的發(fā)病機(jī)理,尋找其遺傳標(biāo)志受到廣泛重視,現(xiàn)已發(fā)現(xiàn):ApoB基因具有明顯的多態(tài)性,其核苷酸變異有75處,其中導(dǎo)致氨基酸變異的有54處,例如多種酶限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLPs),3’端高變區(qū)的數(shù)目可變的串聯(lián)重復(fù)順序(VNTR),信號(hào)肽(SP)多態(tài)性。大量研究表明,ApoB的基因多態(tài)性與動(dòng)脈粥樣硬化有不同程度的關(guān)系。
對(duì)ApoB基因多態(tài)性進(jìn)行檢測(cè)、分析的方法很多,如:限制性?xún)?nèi)切酶的酶譜分析法,PCR直接分析法,PCR產(chǎn)物RFLP分析法,等位基因特異性寡核苷酸(ASO)雜交法等等,其中最多用且簡(jiǎn)單的方法有PCR產(chǎn)物直接分析法和PCR產(chǎn)物RFLP分析法。
PCR產(chǎn)物直接分析法,是采用合適的引物,通過(guò)多次擴(kuò)增,獲得靶基因序列擴(kuò)增片段,直接分析法片段的大小,可用于分析基因的缺失與插入。這種方法簡(jiǎn)便、快速、靈敏,可分析ApoB基因VNTR、SP多態(tài)性。
基因突變往往會(huì)造成限制性?xún)?nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)的改變,如位點(diǎn)丟失或產(chǎn)生新位點(diǎn),通過(guò)PCR擴(kuò)增某一特定片段,再用限制性?xún)?nèi)切酶酶切擴(kuò)增產(chǎn)物,電泳觀察片段的大小,這種方法用于檢測(cè)酶切位點(diǎn)改變的基因突變,可直接判斷基因型,是研究ApoB基因PFLPs的較好方法,具有靈敏、簡(jiǎn)便、可同時(shí)對(duì)大量樣品進(jìn)行分析等優(yōu)點(diǎn)。
ApoB基因多態(tài)性研究較多的有RFLP、VNTR、SP多態(tài)性,分別敘述如下:
1.RFLP的檢測(cè)
ApoB有10種RFLP,一般采用PCR-RPLPs方法進(jìn)行分析,研究較多的有第26外顯子X(jué)baⅠ、MspⅠ位點(diǎn),第29外顯子EcoRⅠ位點(diǎn),在Apob DNA上的位置如圖19-6,圖19-7所示:
圖19-6 ApoB基因部分RFLPS示意圖
圖19-6 ApoB基因多態(tài)性位置示意圖
用于PCR的引物如下:
XbaⅠ-5’GGAGACTATTCAGAAGCTAA
XbaⅠ-3’GAAGAGCCTGAAGACTGACT
EcoRⅠ-5’zxtf.net.cn/jianyan/CTGAGAGAAGTGTCTTCGAAG
EcoRⅠ-3’CTCGAAAGGAAGTGTAATCAC
MspⅠ-5’TCTCGGGAATATTCAGGAACTATTG
MspⅠ-3’CTAAGGATCCTACAATGTCAAGGT
XbaⅠ酶切位點(diǎn)的RFLP是由于2488位密碼子第三個(gè)堿基突變(ACC→ACT),產(chǎn)生一個(gè)XbaⅠ酶切位點(diǎn),但并未改變所編碼的氨基酸序列,存在XbaⅠ酶切位點(diǎn)(X+)的等位基因,其PCR產(chǎn)物酶切后出現(xiàn)433bp和277bp兩個(gè)片段,不存在XbaⅠ酶切位點(diǎn)(X-)的等位基因,PCR產(chǎn)物經(jīng)酶切后仍為其產(chǎn)物710bp片段。
RFLP是由于4154位密碼子改變(GAA→AAA),使原有的EcoRⅠ酶切位點(diǎn)消失,氨基酸序列中賴(lài)氨酸取代谷氨酸,存在EcoRⅠ酶切位點(diǎn)(R+)的等位基因,其PCR產(chǎn)物經(jīng)EcoRⅠ酶切后得到253bp及227bp兩個(gè)片段,不存在EcoRⅠ酶切位點(diǎn)(R-)的等位基因,其PCR產(chǎn)物酶切后仍為480bp的片段。
MspⅠ酶切位點(diǎn)的RFLP,是由于3611位密碼子改變(CGG→CAG),谷氨酰胺取代了精氨酸,含MspⅠ酶切位點(diǎn)(M+)的等位基因,PCR產(chǎn)物經(jīng)MspⅠ酶切后可見(jiàn)到395bp和85bp的片段,不含MspⅠ酶切位點(diǎn)(M-)的等位基因,PCR產(chǎn)物酶切后仍為480bp。
眾多學(xué)者對(duì)ApoB基因RFLPs與動(dòng)脈粥樣硬化之間的關(guān)系進(jìn)行了研究。多數(shù)學(xué)者認(rèn)為ApoE有XbaⅠ酶切位點(diǎn)(X+),無(wú)EcoRⅠ酶切位點(diǎn)(E-),無(wú)MspⅠ酶切位點(diǎn)(M-)的基因頻率,在動(dòng)脈粥樣硬化性疾病的患者中比正常對(duì)照組高,但也有學(xué)者持不同甚至相反意見(jiàn),究其原因,可能有以下幾點(diǎn):①研究樣品例數(shù)不夠,有的少于100個(gè)甚至少于50個(gè),可能使一些有意義的聯(lián)系被忽略;②對(duì)照組的選擇沒(méi)有統(tǒng)一的、嚴(yán)格的、明確的標(biāo)準(zhǔn),有時(shí)與病員組缺乏可比性;③存在種族差異,例如XbaⅠRFLP基因頻率,X+等位基因在高加索人為0.4~0.5,日本人和中國(guó)人則僅為0.04、0.01;④某些遺傳標(biāo)記之間可能存在連鎖關(guān)系,可導(dǎo)致結(jié)論互不相同。
2.VNTR的檢測(cè)
VNTR(數(shù)目可變的串聯(lián)重復(fù)順序)是繼RFLPs之后的又一類(lèi)具有高度多態(tài)性的遺傳標(biāo)記,廣泛分布于人類(lèi)基因組中。ApoB基因3’端高變區(qū)(HVR)包含VNTR,由富含AT的DNA序列組成,其多態(tài)性特點(diǎn)是由10~15bp的核苷酸序列構(gòu)成不同的等位基因,產(chǎn)生不同的重復(fù)序列拷貝數(shù)。以VNTR兩側(cè)特異性序列為引物,經(jīng)PCR擴(kuò)增后直接電泳分析產(chǎn)物,片段之間的差異在于AT重復(fù)次數(shù)不同,重復(fù)37次稱(chēng)為3β"37。依此類(lèi)推,PCR引物可用以下序列:
VNTR-5’ATGGAAACGGAGAAATTATG
VNTR-3’CCTTCTCACTTGGCAAATAC
Boerwinkle等首先檢測(cè)出12種等位基因片段,現(xiàn)有學(xué)者已檢出22種不同等位基因。Frield等的研究發(fā)現(xiàn),產(chǎn)生38、44、46或48個(gè)15bp長(zhǎng)度重復(fù)序列的等位基因與冠心病、血漿膽固醇水平升高有關(guān),且與EcoRi RFLP呈連鎖不平衡,與MspⅠRFLP呈連鎖平衡,Robinson等的研究則沒(méi)有發(fā)現(xiàn)ApoB的VNTR多態(tài)性與血漿膽固醇、甘油三酯、ApoB等水平有關(guān)。
3.信號(hào)肽(SP)多態(tài)性的檢測(cè)
ApoB基因5’信號(hào)肽(SP)由27個(gè)(插入型Ins)或24個(gè)(缺失型Del)氨基酸組成,可經(jīng)PCR擴(kuò)增后直接分析,用于PCR的引物序列為:
IN/DE-5’CAGCTGGCGATGGACCCGCCGA
IN/DE-3’ACCGGCCCTGGCGCCCGCCAGCA
Wu等報(bào)告del/del基因型在高膽固醇血癥患者中比對(duì)照組中多見(jiàn)。Renges等對(duì)倫敦地區(qū)亞洲后裔的研究也發(fā)現(xiàn)帶del基因型者血漿總膽固醇升高,但與冠心病無(wú)明顯關(guān)系。Peacock等提出Ins/del多態(tài)性與冠心病的發(fā)展,即其嚴(yán)重程度有關(guān),也有報(bào)道Ins/del多態(tài)性在冠心病與對(duì)照組中無(wú)明顯差別。
以ApoB基因第26個(gè)外顯子MspⅠ RFLP為例,具體介紹檢測(cè)的方法和步驟,筆者對(duì)湖北地區(qū)健康成人(120例)進(jìn)行了檢測(cè)。
(一)材料
引物(如前所述),TaqDNA聚合酶、dNTP、限制性?xún)?nèi)切酶MspⅠ、高速離心機(jī)、基因擴(kuò)增儀、恒溫水浴箱、電泳系統(tǒng)、紫外監(jiān)測(cè)儀。
(二)方法
1.模板DNA的提取
可采用改良的TritonX-100法提取人白細(xì)胞DNA,此法結(jié)果穩(wěn)定,但操作較繁瑣,在此采用改進(jìn)的Na裂解法提取人白細(xì)胞DNA,簡(jiǎn)便、快速、靈敏、經(jīng)濟(jì),步驟如下:
取EDTANa2抗凝血100μl,15000r/min離心5min,棄上層血漿,加無(wú)菌雙蒸水200μl,搖勻20s,加6mNaI200μl,搖勻20s,再加入氯仿/異戊醇(24/1)400μl,搖勻后15000r/min離心12min,小心吸取上層水相,移入另一離心管,加0.6倍體積的異丙醇,混勻后4℃放置15min,15000r/min離心12min,棄異丙醇,加入70%乙醇洗滌2~3次,室溫干燥,加入5μlTE緩沖液(pH=8.0)溶解DNA12~24h,4℃?zhèn)溆谩?/p>
2.模板DNA的擴(kuò)增
采用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)。反應(yīng)總體積50μl,MgCl2終濃度為1.5mmol/L的1×Buffer,dNTp 0.2mmol/l,引物各20pmol,模板DNA約1.0μg,混勻,短暫離心,95℃預(yù)變性10min,加入Taq酶1.5U,液體石蠟50μl,短暫離心,按94℃ 45sec,60℃ 45sec,72℃1mim 15s循環(huán)30次,72℃延伸5min,置4℃貯存。
3.?dāng)U增產(chǎn)物的提純及酶切
取擴(kuò)增產(chǎn)物20μl,加入醋酸銨至2.5mol/L,與無(wú)水乙醇混勻,4℃沉淀15min,12000r/min離心10min,棄上清,70%乙醇漂洗兩次,室溫干燥后加入含Mspi 10U的緩沖液37℃保溫2h,加入EDTA至10mmol/L終止反應(yīng)。
4.?dāng)U增及酶切產(chǎn)物的檢測(cè)
(1)瓊脂糖電泳:制備2%瓊脂糖(含0.5μg/ml EB),將擴(kuò)增產(chǎn)物與標(biāo)準(zhǔn)DNA(PGEM3zf(+)/HaeⅢ)點(diǎn)樣,電壓4v/cm,電泳,紫外燈下觀察。
(2)聚丙烯酰胺凝膠電泳:將擴(kuò)增及酶切產(chǎn)物加樣于8%聚丙烯酰胺凝膠上,電壓6V/cm,電泳4h,EB染色,紫外燈下觀察。
(3)結(jié)果:擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖電泳,紫外燈下呈一條強(qiáng)熒光帶,與已知DNa Marker相比較,約位于480bp的位置,與設(shè)計(jì)相符。
擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)MspⅠ酶切后,在8%PAGE上,可見(jiàn)到三種類(lèi)型:①原始帶消失,出現(xiàn)兩條新帶,長(zhǎng)度為395bp和85bp,為含酶切位點(diǎn)的M+M+純合子;②酶切后除與擴(kuò)增產(chǎn)物相同位置的原始帶外,還有兩條長(zhǎng)度為395bp和85bp的帶,共三條帶,為M+M-雜合子;③酶切后僅有一條帶,與擴(kuò)增產(chǎn)物位置相同,為無(wú)酶切位點(diǎn)的M-M-純合子。
以上三種基因型,以含酶切位點(diǎn)的純合型(M+M+)最多見(jiàn),120例中有114例,不含酶切位點(diǎn)的M-M-型最少見(jiàn),僅有1例,雜合型(M+M-)有5例,根據(jù)基因頻率計(jì)算方法,等位基因M+頻率為0.97,少見(jiàn)等位基因M-頻率為0.03。
若對(duì)冠心病患者同時(shí)進(jìn)行檢測(cè),計(jì)算基因頻率,可見(jiàn)到:少見(jiàn)等位基因M-在冠心病組比健康對(duì)照組高,有顯著性差異,但無(wú)論在冠心病組還是健康對(duì)照組,各基因型個(gè)體間的血脂、脂蛋白、載脂蛋白水平均無(wú)顯著性差異,這說(shuō)明Apob MspⅠ多態(tài)性與冠心病有關(guān),但與血中脂類(lèi)水平的關(guān)系不明顯,這可能是由于環(huán)境因素,激素及其他遺傳因素對(duì)脂質(zhì)水平的影響較明顯,掩蓋了Apob MspⅠRFLP對(duì)脂質(zhì)的影響,也可能是這種多態(tài)性與ApoB基因上其他位點(diǎn)的多態(tài)性有連鎖關(guān)系。另外,由于少見(jiàn)等位基因M-的頻率很低,有必要加大樣本例數(shù),進(jìn)行進(jìn)一步的研究。