影響
豬腎細胞生長及豬細小病毒增殖的因素淺探
感謝大夫為我快速解答——該如何治療和防治
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在疫苗生產(chǎn)中，利用細胞增殖病毒制備疫苗，成本低且質量穩(wěn)定。因此,此工藝在生產(chǎn)中得到了廣泛的應用。傳代細胞雖然具有生長穩(wěn)定、均一、快速等優(yōu)點，但因存在致
腫瘤的可能性等弊端，因此不能大量用于生產(chǎn)。所以，各種原代細胞以安全可靠，得到了大量應用，如犢牛睪丸細胞、雞胚成纖維細胞、乳豬腎細胞等。原代細胞由于受諸多因素的影響，生長很不穩(wěn)定。那么，如何做好細胞培養(yǎng)是企業(yè)降低生產(chǎn)成本的關鍵。筆者在用乳豬腎細胞增殖豬細小病毒時，總結了一些經(jīng)驗供同行參考。1 培養(yǎng)底物的洗滌：一般培養(yǎng)豬腎細胞的底物多采用轉瓶，材質有塑料或玻璃的。本試驗采用10000mL玻璃轉瓶培養(yǎng)。用洗滌劑進行洗滌，不采用酸堿浸泡，因酸堿浸泡的物品有殘留，對細胞的生長會有較大的影響。在多次生產(chǎn)試驗中，細胞生長良好，貼壁效果較為理想。2 供體仔豬日齡：仔豬日齡越小，細胞分化越好，繁殖能力越強。在生產(chǎn)豬腎原代細胞時，我們分別選取1、3、5、7、9、11、13日齡的健康仔豬各2頭，每頭豬腎制備2個轉瓶,相同條件培養(yǎng)，觀察細胞長成單層的速度和形成單層后進行1∶5傳代細胞的生長速度。結果用1、3、5、7日齡仔豬腎制備的豬腎原代和次代細胞生長成單層的速度無顯著差別；用9、11、13日齡仔豬腎制備的原代細胞生成單層的時間較前者平均慢1~2 d,利用9日齡豬腎制備的次代細胞長成單層時間較長，用11、13日齡仔豬腎制備的次代細胞生長不好，不能形成單層。3 仔豬生理狀況：用于生產(chǎn)豬腎細胞的仔豬應健康，不應感染有傳染�。簧眢w不健康直接影響原代細胞的生長活力。4 細胞營養(yǎng)液：乳漢液按《獸用生物制品制造及檢驗規(guī)程》（2000版)規(guī)定的方法制備，應注意以下幾點。4.1 稱取各種試劑藥品要準確，嚴格按規(guī)程要求的方法按順序稱取，不得將物品的順序顛倒。溶解時要等先加入的試劑溶解了再加入另一種試劑，甲液和乙液配好后，要將乙液緩緩加入到甲液中并混合均勻。然后按要求加入水解乳蛋白。4.2 乳漢液培養(yǎng)液配好后，應檢驗溶液的緩沖系統(tǒng)是否具有緩沖能力，如緩沖效果不好或不具有緩沖的能力應將其棄之，重新配制。5豬腎細胞的制備 (1)豬腎組織塊的制備：無菌摘取乳豬腎，除去包膜和腎的髓質，盡量將其去凈，因過多的髓質會影響細胞的生長。做好后，用乳漢液洗滌2~3次，用無菌的剪子將其剪成1~2 mm的小塊后，再洗滌2~3次，洗至液體澄清為止。(2)細胞消化與分散：在細胞消化時，液體的pH應調至略堿性，效果較好。消化時間不應將預熱時間計算在內(nèi)。消化時間一般為30~50 min，并視消化程度而定。消化期間要振搖數(shù)次。待組織塊周圍有30%左右出現(xiàn)絮狀物時，就已消化好了，不能等完全出現(xiàn)絮狀物時再停消。這時就已消化過重，細胞的細胞膜就已部分被破壞。死細胞較多，不利于細胞生長。 細胞分散目前多采用玻璃珠搖動使其分散，搖時用力不要太大。防止在培養(yǎng)時死細胞過多，會產(chǎn)氨使液體的酸堿度升高，不利于細胞生長。此外用紗布濾過時，紗布的層數(shù)不要過多，2~3層紗布即可，因為“細胞團”生長一般較好。此外組織也可多次消化，效果一般較好，但較繁鎖易造成污染。(3)轉瓶培養(yǎng)速度：原代細胞培養(yǎng)一般轉瓶的速度為6~10 r/h。在生產(chǎn)中一般慢速比快速貼壁的效果好，先慢速后快速的效果會更好，貼壁后，一般快速比慢速細胞生長好。原代細胞的貼壁時間一般為10多個小時左右，次代細胞的生長速度較快，多在3~5 h，操作者可以根據(jù)需要調整轉瓶機的轉速來達到最佳的貼壁效果。6 豬細小病毒的增殖(1)豬細小病毒的接毒時間，應待豬腎原代細胞有30%~50%生長為細胞單層時接毒，也有同步接毒的，但效果不好。細胞少比細胞多時產(chǎn)毒效果好，收獲的病毒液毒價高。我們?yōu)榱吮容^其產(chǎn)毒效果，分別取20%、30%、40%、50%、60%生成單層的豬腎細胞轉瓶各2瓶。相同條件培養(yǎng)增毒測其病毒液效價見表1表1乳豬腎原代細胞和次代細胞的增毒效價細胞類別 病毒液效價1 病毒液效價220% 1∶128 1∶25630% 1∶512 1∶51240% 1∶512 1∶51250% 1∶512 1∶25660% 1∶128 1∶64(2)豬細小病毒（PPV)的體外復制是殺細胞性的，主要表現(xiàn)為細胞隆起、固縮、溶解。適應了細胞培養(yǎng)的病毒在適宜條件下生長時，能使細胞產(chǎn)生廣泛的病變。但在，最初分離病毒時，在沒有見到細胞病變（CPE)時，應將病毒，更確切的說，應將受感染的細胞培養(yǎng)物連傳幾代。免疫熒光顯微鏡的使用大大提高了細胞培養(yǎng)物中微量PPV的檢出率。雖然有幾種細胞用作增殖和滴定PPV是敏感的，但最常用還是胎兒或新生豬的原代或次代細胞。通過對正處在分裂期的細胞培養(yǎng)物進行感染，由于當培養(yǎng)物中很多細胞處于其分裂周期的S期（即DNA合成期)時，病毒可獲得復制所需要的細胞源性DNA聚合酶。將有助于PPV的復制。(3)如果將胎兒或成年牛的血清用于PPV繁殖的細胞培養(yǎng)物中，應預先測定其中是否含有病毒抑制因子。另外，對所有的細胞培養(yǎng)物也應檢查有無PPV的污染。(4)利用免疫熒光顯微鏡檢查細胞培養(yǎng)物中PPV的增殖情況。一般情況下，該病毒的復制情況如下：如果接種物中含有高滴度的病毒和病毒抗原，很快就能從感染細胞的胞漿中查到病毒抗原，這種早期細胞的熒光大多數(shù)是由于細胞直接吞噬了接種物中的抗原產(chǎn)生。連續(xù)檢查發(fā)現(xiàn)，這些抗原首先在細胞膜外表面出現(xiàn)，然后見于細胞漿，通常相對集中見于靠近細胞核的位置。病毒復制的最早，最明確的證據(jù)是新產(chǎn)生的病毒抗原出現(xiàn)在核內(nèi)。隨后，至少一部分感染細胞的胞漿內(nèi)出現(xiàn)大量的新合成的抗原，致使細胞漿和細胞核都帶有明亮的熒光。受感染的細胞隨后隆起、固縮、裂體并釋放出病毒和病毒抗原。培養(yǎng)物中其他處于不適宜病毒復制階段的細胞則繼續(xù)向胞漿內(nèi)吞噬，
積聚病毒抗原。如果刺激這些細胞進入S期，如通過加入新鮮培養(yǎng)液，則可以誘導出第二個病毒復制高峰。(5)血凝試驗（HA)：通常在室溫下進行，pH接近中性，使用豚鼠紅細胞。據(jù)記載，
巴比妥緩沖液比磷酸鹽緩沖液作稀釋液得到的HA滴度更高（Rucker Bauer等，1978)。
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