人工授精最佳方案重點(diǎn)
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豬場(chǎng)中的最佳授精方案主要是降低授精量而不降低繁殖力。當(dāng)在排卵前24小時(shí)期間進(jìn)行授精時(shí)，高質(zhì)量精液的授精可獲得好的繁殖力。然而，因?yàn)槟肛i排卵時(shí)間不能在24小時(shí)內(nèi)預(yù)知，所以，縱使清楚這個(gè)最佳時(shí)間，但為了得到最佳授精效果，這段時(shí)間和/或排卵時(shí)間的預(yù)測(cè)還是需要改進(jìn)的。有關(guān)授精的時(shí)間安排——發(fā)情周期的相對(duì)特征和繁殖力（母豬產(chǎn)仔率，一窩產(chǎn)仔數(shù))的關(guān)系已在六十年代和七十年代就進(jìn)行過研究。九十年代早期以來，超聲波已應(yīng)用到自然排卵母豬排卵時(shí)間的預(yù)測(cè)上。實(shí)驗(yàn)中，根據(jù)母豬行為和生理學(xué)方面的變化進(jìn)行母豬的排卵時(shí)間安排及授精方案對(duì)受精的影響，完善了現(xiàn)有知識(shí)。而且，授精時(shí)間的安排，授精期間環(huán)境對(duì)授精的影響至關(guān)重要。此外，本文還提及了關(guān)于公豬出現(xiàn)對(duì)子宮運(yùn)動(dòng)作用的最新資料（Langendijk,2001)，以及授精和排卵期間的最佳時(shí)期�！ ∨怕押舐训膲勖约澳芤鹗诰淖銐驍�(shù)量精子的壽命，決定了輸卵管中成功受精的排卵相對(duì)時(shí)期（Hunter,1994)。六十年代已經(jīng)開展的研究表明，發(fā)情周期中授精相對(duì)較早或較晚的母豬的受精率嚴(yán)重下降。（Hancock和Hoveu,1962)，而且母豬產(chǎn)仔率和一窩產(chǎn)仔數(shù)下降亦很大。（Willemse和Boender，1967)。從這些實(shí)驗(yàn)看出，因?yàn)榕怕褧r(shí)間隨發(fā)情周期變化很大，因此對(duì)精子壽命和發(fā)情周期是很難下結(jié)論的（Soede和Kemp，1997)。所以在這些實(shí)驗(yàn)中，通常使用人工排卵的小母豬來研究受精過程（例如，Dziuk,1970;Hunter,1967;Hunter,1981;Hunter et al.,1987)。這些實(shí)驗(yàn)都表明：精液的運(yùn)輸、精子細(xì)胞的獲能和精液量的多少均對(duì)授精至關(guān)重要�！ 〗鼛啄陙�，有關(guān)自然排卵的相對(duì)受精機(jī)會(huì)的研究已有報(bào)道。研究發(fā)現(xiàn)，在一些母豬中，當(dāng)在排卵前40小時(shí)到排卵后16小時(shí)之間進(jìn)行授精（30億精子細(xì)胞用量)時(shí)，受精效果理想（Soede et al.,1995a)。然而，要使多數(shù)母豬都取得理想的受精結(jié)果，授精則須在排卵前12小時(shí)（Waberski et al.,1994a)或24小時(shí)期間（Waberski et al,1994b;Soede et al.,1995ab;Steverink et al.,1997)進(jìn)行，見圖1�！ ∫�30億精子細(xì)胞做為一個(gè)授精劑量進(jìn)行授精后，受精率因排卵的可變間隔可分別為0%、1-20%、21-40%、41-60%、61-80%、81-99%和100%（摘自Soede et al.,1995ab和Steverink et al.,1997)。從以上結(jié)論可看出，當(dāng)在排卵之前進(jìn)行授精，受精結(jié)果最佳。在排卵前0~24小時(shí)內(nèi)，多數(shù)母豬受精率達(dá)100%，在這個(gè)時(shí)段之外，部分受精的母豬的百分比和沒有受精的母豬的百分比均有所升高�；谀肛i產(chǎn)仔率和一窩產(chǎn)仔數(shù)，授精和受精之間的最佳間隔可以更長(zhǎng)一些，可在排卵前28小時(shí)至排卵后4小時(shí)之間進(jìn)行（Nissen et al.，1997)。而事實(shí)上大約24小時(shí)的間隔會(huì)導(dǎo)致受精率下降，這意味著多數(shù)母豬中，大多數(shù)精子的受精壽命被限制在24小時(shí)內(nèi)。在排卵之前進(jìn)行授精會(huì)導(dǎo)致受精率的下降，這就是說，卵母細(xì)胞的受精壽命大約和精子與之結(jié)合并到達(dá)受精位置的時(shí)間相近似。然而，即使是在最佳時(shí)期內(nèi)，仍有部分母豬受精不理想，甚至沒有受精（見圖1)�！ 〗鼇�，有關(guān)何時(shí)授精才能獲得最佳受精結(jié)果這一問題，已做了大量的試驗(yàn)。下列各項(xiàng)影響因素已得到調(diào)查： 1.貯存過程中精子老化；雖然授精時(shí)精子超過38小時(shí)并不影響結(jié)果（Soede et al.,1995)，但使用老化精液縮短了授精的最佳時(shí)期（Waberski et al., 1994b)�！ �2.稀釋液；精液貯藏對(duì)授精最佳時(shí)間的負(fù)影響主要取決于采用的稀釋液（Waberski et al.,1994b)。 3.精液量；精子是從10億到60億幾乎不能影響授精的最佳時(shí)期�！ �4.冷凍精液；使用冷凍精液時(shí)，要在授精最佳時(shí)期排卵前0~4小時(shí)進(jìn)行�！ �5.精液回流；只有在精子量少（10億)授精和回流超過20ml（共80ml時(shí))授精時(shí)的精液回流，才會(huì)影響受精。授精后的精液回流對(duì)受精沒有影響（Steverink et al.,1998)�！ 】傊瑥纳厦婵梢钥闯�，是到達(dá)輸卵管的精子數(shù)量和/或質(zhì)量降低的因素，縮短了最佳受精的授精時(shí)間。可以推斷，在排卵前0-24小時(shí)進(jìn)行授精，使用高質(zhì)、最多2日齡的精子，可以使受精率大為提高。但奇怪的是，即使授精量加倍，也很難獲得理想的效果�！ 〗鼇淼膶�(shí)驗(yàn)表明，完全可以提高精子運(yùn)動(dòng)和/或存活率，其可能性如下： 1.提高精子質(zhì)量？ 除了運(yùn)動(dòng)性，精子的一些體外因素也與體內(nèi)受精結(jié)果有關(guān)（Colenbrander,2000)。近來，研究發(fā)現(xiàn)，（公牛和公豬)精子細(xì)胞有與透明帶或透明帶蛋白結(jié)合的能力。Harkema et al （1998)發(fā)現(xiàn)，經(jīng)3小時(shí)培養(yǎng)，血管內(nèi)液中與透明帶蛋白結(jié)合的公豬精子細(xì)胞（可能是獲能精子細(xì)胞)的比例達(dá)到最高峰。高峰的水平隨公豬個(gè)體而變化極大（Harkema et al,2002)。四頭公豬的精子經(jīng)3小時(shí)培養(yǎng)后，分別有31%、40%、45%和53%的精子與透明帶蛋白結(jié)合力增強(qiáng)，體內(nèi)卵母細(xì)胞受精率（排卵后用5億精子細(xì)胞立即授精)平均為77%、82%、87%和94%，有40%、62%、67%和83%的母豬的卵細(xì)胞與精子的受精率達(dá)100%。（Harkema et al,2002)。因此，公豬精子細(xì)胞體外獲能的差別與體內(nèi)受精結(jié)果密切相關(guān)。這種正相關(guān)性是否在排卵前而非排卵后授精時(shí)發(fā)生值得探討。如果體外透明帶結(jié)合率與體內(nèi)精子細(xì)胞受精壽命存在相關(guān)的話，公豬的平均受精率可能相近，這將使之不能成為公豬選種的有效工具。然而若將不同公豬精子進(jìn)行選擇性混合可能有助于受精�！ �2.減少精子細(xì)胞吞噬量？ 精子授精后1小時(shí)內(nèi)不能到達(dá)輸卵管，主要是由于細(xì)胞的吞噬作用。Rozeboom et al （1999)發(fā)現(xiàn)授精過程中精漿的摻入引起白細(xì)胞流入子宮腔的比率改變。資料進(jìn)一步表明，授精方式影響白細(xì)胞對(duì)精子的吞噬作用。（Woelders,2001)。因此，對(duì)白細(xì)胞的流入量和其對(duì)精子細(xì)胞的吞噬進(jìn)行調(diào)控可以改變到達(dá)受精部位的精子數(shù)和受精比率。 3.授精過程：進(jìn)行子宮的（深部位)授精？ 特別是在精液昂貴的時(shí)候，由于精子數(shù)量較少，因此授精過程非常重要。（例如，有特定遺傳基因組成的公豬精液)。在西班牙（Martinez et al.,2001)和德國(guó)（Rath et al.,1999)實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)研究出了子宮深部位授精程序。用5千萬(wàn)精子進(jìn)行授精，成功引起母豬懷孕。農(nóng)場(chǎng)試驗(yàn)中，在子宮頭蓋部進(jìn)行授精（非子宮深部)。這表明此項(xiàng)技術(shù)允許精液量減少到10億（Waston 2001)。然而，目前的子宮授精技術(shù)的弱點(diǎn)在于僅對(duì)老的同等母豬的限制性使用和缺乏技術(shù)熟練的授精人員不易掌握�！ �4.母豬的特征？ 品種不同，卵母細(xì)胞繁殖壽命也不同（Kemp和Soede,1997)。但是，對(duì)可能影響母豬的諸如獲能比率、子宮的運(yùn)動(dòng)、精液的傳送或精液在生殖區(qū)的生存等方面的因素仍知之甚少。然而，最近已有資料報(bào)道影響子宮運(yùn)動(dòng)性的因素（見下文)�！ 】傊�，在母豬的生殖腔中，進(jìn)一步提高精子的傳送和生存能力有諸多可能性。這些進(jìn)步將使授精量減少或不太理想條件下（精液老化，授精人員不熟練)提高受精率。在這方面，授精時(shí)公豬出現(xiàn)顯得非常重要（見下文)�！ ∨怕褧r(shí)間的預(yù)測(cè)標(biāo)準(zhǔn)： 排卵基本上開始于發(fā)情后35到45小時(shí)之間（公豬出現(xiàn)后的靜立反應(yīng))。然而，母豬間的差異是很大的。比如在10~85小時(shí)之間（Weitze et al.,1994)或10~58小時(shí)之間（Soede et al.,1995a)，即使有時(shí)沒發(fā)現(xiàn)差別。另外陰道的溫度和陰道內(nèi)粘液潤(rùn)滑性也不是排卵時(shí)間的理想預(yù)測(cè)標(biāo)準(zhǔn)（Soede et al.,1997;Stokhof et al.,1996)�！ 【攀甏�，在德國(guó)、荷蘭、瑞士、丹麥的調(diào)查中，一般排卵時(shí)間安排（發(fā)情比例)在64~72%之間變動(dòng)（Soede和Kemp,1997)。發(fā)情持續(xù)時(shí)間（也就是母豬在見到公豬后發(fā)生的靜立反應(yīng)的一段時(shí)間)在排卵時(shí)間的50-60%之間變動(dòng)。因此，發(fā)情持續(xù)時(shí)間看起來是發(fā)情時(shí)對(duì)排卵時(shí)間的最好估計(jì)指標(biāo)。但發(fā)情持續(xù)時(shí)間極易發(fā)生改變，對(duì)排卵時(shí)間只能提供回顧性的估計(jì)指標(biāo)。所以，研究應(yīng)致力于尋求其它用于排卵時(shí)間安排的預(yù)期估計(jì)指標(biāo)�！ ≡诎l(fā)情期間，母豬對(duì)所采取的促進(jìn)發(fā)情的刺激所作出的反應(yīng)先增強(qiáng)后降低（Willemse和Boender,1967)。這就是說，發(fā)情的早晚期，母豬對(duì)強(qiáng)烈刺激（如交配區(qū)探查或公豬的緊密接觸)作出反應(yīng)。當(dāng)處于發(fā)情中期時(shí)，其對(duì)較低強(qiáng)度的刺激也能作出反應(yīng)。（如公豬不在時(shí)進(jìn)行壓背法)。在發(fā)情期間，通過不同強(qiáng)度的刺激，可以區(qū)分出不同的敏感期（如公豬不在時(shí)對(duì)壓背法的敏感性，公豬與其以柵欄相隔時(shí)對(duì)壓背法的敏感性，或進(jìn)行交配區(qū)探查時(shí)對(duì)壓背法的敏感性)。Langendijk et al.,（2000b)進(jìn)行了發(fā)情探查時(shí)不同強(qiáng)度的刺激可否區(qū)分更多的反應(yīng)時(shí)期和是否能用于更精確的排卵預(yù)測(cè)兩方面的研究，但結(jié)果并不理想。大多數(shù)母豬在發(fā)情期對(duì)低強(qiáng)度刺激根本不表現(xiàn)出靜立反應(yīng)。因此，不能區(qū)分發(fā)情期不同的反應(yīng)時(shí)期。而且，即使發(fā)情時(shí)母豬表現(xiàn)出更多的反應(yīng)時(shí)期，這些時(shí)期也與排卵時(shí)間聯(lián)系甚少�！ 《鄥�(shù)（體質(zhì)和行為方面)的結(jié)合對(duì)排卵時(shí)間的估計(jì)可能比單一參數(shù)效果好。Langendijk et al （1999b)最近進(jìn)行了一次嘗試，他把母豬內(nèi)陰的潮紅溫度與發(fā)情行為特征結(jié)合起來。母豬開始發(fā)情時(shí)，陰部變紅的母豬大約占60%，其一般在排卵前18小時(shí)由潮紅變?yōu)榉奂t，并且始終在排卵前36小時(shí)和排卵后2小時(shí)之間變動(dòng)。在研究中，雖然沒有檢測(cè)到激素，但陰部由潮紅到粉紅的變化可能與發(fā)情變化有關(guān)。如果這些結(jié)果正確，那么那些在發(fā)情開始內(nèi)陰戶就潮紅的母豬沒有必要在陰部潮紅消退前進(jìn)行授精，這樣精子就得到合理的利用�！ ∪襞怕褧r(shí)間取得最終的預(yù)測(cè)，那么就可以用簡(jiǎn)單的方式來控制催乳激素的上升或激素結(jié)合物的下降。但對(duì)豬來說，這是不切實(shí)際的。不久的將來，母豬發(fā)情周期的推測(cè)勢(shì)必應(yīng)著眼于排卵時(shí)間的預(yù)測(cè)�！ 〗⒏行У氖诰桨福骸 “l(fā)情行為的變化以及相關(guān)的排卵時(shí)間的低預(yù)測(cè)性使得在排卵前最佳時(shí)期母豬的一次性授精更為困難。因此，大多數(shù)母豬在發(fā)情期間要重復(fù)多次授精。目前的問題是重復(fù)授精是否應(yīng)在12~24小時(shí)之間進(jìn)行。Lemberson和Safranski（2000)結(jié)合每天1~2次發(fā)情檢查的結(jié)果對(duì)不同授精計(jì)劃做過經(jīng)濟(jì)上的比較。在他們的模型中，懷孕的幾率大于90%（排卵期間進(jìn)行授精)，而在排卵前24小時(shí)和排卵后6小時(shí)進(jìn)行授精時(shí)，幾率降低到62%，發(fā)情后40±12h，發(fā)生排卵，從斷奶到排卵的時(shí)間在136±18h左右。應(yīng)用這些參數(shù)，在12小時(shí)期間進(jìn)行授精，經(jīng)濟(jì)回報(bào)最高。在發(fā)情后12、24和36小時(shí)，每天進(jìn)行2次發(fā)情檢查，在發(fā)情后0、12、24和36小時(shí)，每天進(jìn)行一次檢查。這些都是在排卵前的12小時(shí)內(nèi)進(jìn)行授精所見到的受精率邏輯上的結(jié)果（相對(duì)較低)。德國(guó)豬場(chǎng)的調(diào)查結(jié)果表明，每12小時(shí)進(jìn)行一次授精的畜群，其繁殖力并不比每24小時(shí)授精一次的畜群好。（VFV，1999)。相似的是，Castagna et al.,（2001)和Thorup（2001)也從他們的試驗(yàn)中得出結(jié)論，認(rèn)為，每隔12小時(shí)和24小時(shí)進(jìn)行授精，其繁殖力相近。后來的結(jié)果比以前提及的授精試驗(yàn)的結(jié)果（Waberski et al.,1994b;Soede et al.,1995；Nissen et al.,1996;Steverink et al.,1997)更清楚反映了每24小時(shí)進(jìn)行授精是充分的�？墒牵T如技術(shù)不熟的授精人員（Flowers,1994)或精子老化（Waberski et al,1997)等因素可能會(huì)縮短授精間隔時(shí)間。 過頻的授精不僅浪費(fèi)精子、勞動(dòng)力和金錢，還有很多負(fù)面影響。Rozeboom et al（1997)在發(fā)情前后進(jìn)行再次授精降低了母豬產(chǎn)仔率和每窩產(chǎn)仔數(shù)。De Winter et al.，（1992)認(rèn)為在發(fā)情前后進(jìn)行授精，其子宮受感染機(jī)會(huì)遠(yuǎn)大于發(fā)情早期和中期。這種現(xiàn)象與發(fā)情率有關(guān)，影響血流量和白細(xì)胞匯集以及子宮的收縮�！ ∫虼�，過度集中的授精措施，會(huì)導(dǎo)致繁殖力下降，這與發(fā)情前授精引發(fā)感染有關(guān)�！ ∏‘�(dāng)?shù)倪\(yùn)用發(fā)情周期 因?yàn)榕怕演^為固定的發(fā)生在發(fā)情的2/3時(shí)期，因此，發(fā)情周期的推斷既是排卵的間接推斷，又是授精最佳時(shí)間的推斷�？墒前l(fā)情周期變化異常，受多方面因素的影響，例如，畜舍的條件，緊張程度，季節(jié)，平等性，基因背景等（Soede和Kemp,1997)。不過在一定范圍內(nèi)，發(fā)情周期的推測(cè)是可能的。首先，雖然不同的豬場(chǎng)平均發(fā)情周期變化很大（31~65小時(shí))，但對(duì)同一豬廠，月與月之間是一致的（Steverink et al.,1999a)。這表明，發(fā)情期授精的最佳時(shí)間因豬場(chǎng)的不同而有變化。再次，發(fā)情周期與斷奶—發(fā)情間隔（WOI)密切相關(guān)。（Rojkittikhun et al.,1992,Weitze et al.,1994;Kemp和Soede,1996)。通常WOI短的（3-4天)母豬發(fā)情周期長(zhǎng)。這與排卵時(shí)間提前有關(guān)（Weitze et al 1994;Kemp和Soede,1996)。Steverink et al（1999a)發(fā)現(xiàn)在54家豬場(chǎng)中，有43家WOI和發(fā)情周期的關(guān)系非常密切，約占80%。因此，在多數(shù)豬場(chǎng)，WOI為6天的母豬應(yīng)在發(fā)情剛剛開始后不久就進(jìn)行授精，以確保在排卵之前進(jìn)行初次授精。表1闡述了平均發(fā)情周期不同的兩家豬場(chǎng)，其發(fā)情周期與最佳授精時(shí)間的關(guān)系（Steverink et al 1999b)。這些數(shù)據(jù)均來自豬授精方案模型（PIGSIS；Steverink 1999)。模型證實(shí)了初次授精時(shí)間很容易太晚，特別是在發(fā)情周期短，母豬WOI為5-6天的豬場(chǎng)。初次授精過早并不是個(gè)大問題，可以再次授精，但應(yīng)避免在發(fā)情過后授精。因此，為了深入了解授精方案的有效度（以及發(fā)情檢查的質(zhì)量)，場(chǎng)主們應(yīng)建立發(fā)情周期表，還應(yīng)把WOI對(duì)發(fā)情周期的影響考慮在內(nèi)，以便對(duì)母豬個(gè)體授精時(shí)間安排的最佳化進(jìn)行檢測(cè)�！ ”�1. 對(duì)一個(gè)平均發(fā)情周期為36-60小時(shí)的豬場(chǎng)，與排卵有關(guān)的初次授精的時(shí)間安排，用PIGSIS模擬。在兩個(gè)豬場(chǎng)，在發(fā)情開始后24小時(shí)進(jìn)行授精，每24小時(shí)，WOI就上升，同時(shí)伴隨著發(fā)情周期下降6小時(shí)。
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