豬精液超低溫保存技術
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研究歷史及應用用鮮精進行人工授精 人工授精可以說是提高畜禽繁殖率最重要的管理工作。20世紀初，丹麥的種馬育種者Sand和Stribolt是最早將人工授精用作商業(yè)性工具以最大限度地利用優(yōu)良種馬精液的育種工作者，而俄羅斯研究人員Ivanoff是首位將人工授精技術在馬、家禽、牛和
綿羊生產(chǎn)上大規(guī)模成功應用的人�！ ∮眯迈r精液進行人工授精有眾多的好處，包括可以通過控制某些病原體的傳播來改善畜禽的健康、提高豬場的生物安全水平，并且由于可以減少公畜(禽)的飼養(yǎng)量而降低生產(chǎn)成本。然而，這項技術的主要益處是，通過利用來自遺傳學上的優(yōu)良種畜(禽)精液給眾多的母畜禽)進行授精，使得遺傳改良速度得到顯著的提高。在這方面，加拿大魁北克省(Quebec)90％左右的商業(yè)性生產(chǎn)豬群是用新鮮精液進行人工授精的；l983年至2003年間，肉豬背膘下降7 mm，出生到l00 kg上市體重的飼養(yǎng)期減少了26 d�！ 〕蜏乇４胬鋬鼍旱臐撃堋 【旱拈L期保存能給擁有優(yōu)秀種畜禽的生產(chǎn)者帶來額外的好處。自從
甘油可以作為精子的一種高效冷凍保護劑這一里程碑式的發(fā)現(xiàn)問世以來，由于甘油在冷凍過程中能夠緩和稀釋媒介的溶質濃度差，低溫保存已成為精液長期保存的最實用方法，并且已經(jīng)有報道稱成功地實現(xiàn)了牛精子的超低溫冷凍。雖然每次輸精時所需的冷凍精液劑量要多于新鮮精液，但是超低溫保存技術大大地促進了農(nóng)業(yè)優(yōu)良基因的推廣，因為冷凍精液能夠很方便地進行遠距離運輸，并能夠保存到母畜發(fā)情時使用，一份備用的冷凍精液能夠使已死亡或生病的供精公畜繼續(xù)得到使用。 對養(yǎng)豬業(yè)更為重要的是，利用冷凍精液將有利于控制某些病原體的傳播，從而可保護畜群的健康。超低溫保存精液的生物安全保存，能夠將突發(fā)的傳染性疾病和自然災害(如火災)所造成的不良影響減至最低程度。此外，公豬及其精液可在傳染性病原體上得到有效的篩選。當然，已有報道稱，可引起仔豬爆發(fā)斷奶后多系統(tǒng)衰竭綜合征的豬圓環(huán)病毒病2型可被排入表面健康的公豬精液內(nèi)。此病最近已在許多地方，尤其是加拿大、美國和歐洲，越來越受到格外的關注。此外，PCV一2感染在豬群中的流行性遠高于PMWS，而且不一定會導致感染豬出現(xiàn)臨床癥狀或不出現(xiàn)由PMWS引發(fā)的病變。同樣，豬繁殖與呼吸綜合征是全球的一種重要疾病。雖然豬繁殖呼吸綜合征病毒主要傳播是通過與感染豬或污染物的直接接觸，但已有證明小母豬用來自PRRS病毒感染公豬的精液進行人工授精(AI)后出現(xiàn)了血清陽轉。此外，公豬的病
毒血癥和血清學狀態(tài)不足證明PRRS病毒或PRRS病毒RNA已被排泄入精液中。以上述兩種疾病為例，對擁有較高健康水平的養(yǎng)豬場而言，最好在進行人工授精前對特定批次的精液進行篩選。然而，在等待結果期間要求對精液進行低溫冷凍保存�！ 榇_保全球的生物安全，成功的豬精液超低溫保存是國際市場所不可缺少的。根據(jù)陸生動物衛(wèi)生法典第3.2.2.6條“豬精液的包裝和儲存適用條件”規(guī)定，供出口的豬精液應該盛放在滅菌的燒瓶中并分開保存在液氮中至少28 d�！ 〗⒃谟昧魇郊毎诌x儀分離攜帶x染色體或Y染色體的精子基礎上的性別預選已成為現(xiàn)實，并且通過體外受精和胚胎移植，或使用極低劑量的精液進行子宮內(nèi)深部輸精后，已經(jīng)產(chǎn)出所需性別的仔豬。研究表明，性別預選技術在養(yǎng)豬生產(chǎn)中的應用將會對育種方案、豬舍設計、營銷策略以及繁殖效率產(chǎn)生極大的影響。性別分選精液的超低溫保存是商業(yè)生產(chǎn)中不可缺少的，此項技術目前已經(jīng)在牛上建立起來。然而，與性別分選精液相配套的冷凍和處理規(guī)程并不太適合于豬的商業(yè)性應用，對其它哺乳動物而言也是如此。最后，基因庫的有效性取決于超低溫保存實用種質的可用性。根據(jù)聯(lián)合國糧食和農(nóng)業(yè)組織的規(guī)定，農(nóng)業(yè)生物多樣性必須得到保護。該組織的“生物多樣性保護條約”規(guī)定，其中包括家養(yǎng)動物在內(nèi)的食品和農(nóng)業(yè)的遺傳資源是全球食品安全的生物基礎。家畜基因庫構成了一個遺傳適應性儲庫，后者在應對環(huán)境的變化(如全球變暖、普遍存在的內(nèi)分泌干擾因子)、疾病、人類營養(yǎng)所需的新物質、變化的市場條件和社會需求(所有這些均是不可預知的)中充當一個緩沖區(qū)的角色。不可能僅選擇“潛在”重要的特性進行保存。事實上，保留物種的變異性非常重要，特別是商業(yè)生產(chǎn)的壓力要求生產(chǎn)者減少動物品種的變異性以產(chǎn)出均勻的動物供應市場。商用梅山雜種豬由于引入了原產(chǎn)地中國太湖豬的高繁殖率特性而表現(xiàn)出農(nóng)業(yè)生物多樣性的潛力，具有西方豬種的胴體特性。稀有品種組織已經(jīng)啟動了活體動物保存的“寄養(yǎng)農(nóng)業(yè)計劃”，但對豬而言此類努力往往不如家禽和小型反芻動物那樣成功，因為很難找到愿意寄養(yǎng)豬的農(nóng)場主�！ ”M管精液的長期保存具有潛在的優(yōu)勢，但眾所周知豬精子對低溫非常敏感。甚至經(jīng)過數(shù)十年的研究之后，超低溫的精子保存技術繼人工授精在商業(yè)性養(yǎng)豬生產(chǎn)系統(tǒng)中應用之后仍不足以產(chǎn)生可靠的繁殖力�！ 【拥墓δ堋 【荧@能 剛射精的精液是不能進行受精的，首先必須完成獲能及滲入卵母細胞前的頂體反應。精子獲能廣義上是指精子進行功能性修飾，使精子具有與卵子發(fā)生受精的能力。在體內(nèi)，精子獲能很大程度會受到雌性生殖道的互作影響，不過包括豬在內(nèi)的許多動物其精子能夠在體外再次獲能。因獲能引發(fā)的功能改變包括精子完成頂體反應所需的能力、所要求將精子從輸卵管壁上解脫出來的能力、精子滲入輸卵管內(nèi)及卵丘細胞間粘液的能力和精子穿越透明帶的能力�！ 【荧@能受外在因素和內(nèi)在因素的雙重影響，因此一旦受到外源性因子的啟動，獲能過程似乎會自然而然地繼續(xù)發(fā)生。事實上，獲能后的精子極其脆弱，容易產(chǎn)生自發(fā)性的頂體反應�！ 【蛹毎ぶ心懝檀嫉娜コ路鹗且l(fā)精子獲能和發(fā)生頂體反應的信號通道的最早激活子。膽固醇流出可增強膜的流動性，同時也能改變離子通道的活性，使鈣離子和碳酸氫根離子的流動從中獲益。鈣離子和碳酸氫根離子能直接激活精子內(nèi)可溶性腺苷酸環(huán)化酶，以催化形成cAMP。豬精子中的cAMP形成發(fā)生在孵育后的數(shù)分鐘內(nèi)，表明導致精子獲能的信號通道迅速打開�！ 【拥鞍椎�
酪氨酸磷酸化 繼發(fā)現(xiàn)小鼠精子獲能期間許多酪氨酸磷化以cAMP依賴性方式產(chǎn)生后，已在其他動物中記錄到了精子獲能期間酪氨酸磷蛋白的產(chǎn)生。大多數(shù)酪氨酸磷蛋白出現(xiàn)在鞭毛附近，并且很可能參與了精子運動能力的調控和超活化�！ ∝i精子的蛋白質酪氨酸磷酸化在某種程度上不同于已經(jīng)報道的其它動物精子蛋白質的酪氨酸磷酸化。與精子獲能同時發(fā)生的是出現(xiàn)了由多種蛋白質組成的遷移至Mr 32 000處的酪氨酸磷蛋白復合體，即為“p32”。豬精子中與其獲能有關的酪氨酸磷蛋白位于精子的頭部而非鞭毛處，由此暗示其在精子獲能、頂體反應或與母豬生殖道之間的相互作用上起著一定的作用。此外，雖然豬精子的獲能依賴于碳酸氫鹽、鈣離子和cAMP，但p32的出現(xiàn)主要取決于鈣的濃度。事實上，p32的出現(xiàn)與精子細胞的鈣水平和頂體丟失有關，并且很可能代表了一個可導致頂體反應的信號分子。該假設已經(jīng)得到筆者最近證明p32的一個主要組件是“頂體結合蛋白”(可催化頂體蛋白酶的成熟)的結果所支持。對豬人工授精行業(yè)而言，非常有意義的是p32在豬精液冷凍期間出現(xiàn)�！ №旙w反應 頂體反應是發(fā)生在獲能精子上的一種細胞外生理活動，它因精子與卵子透明帶結合而被激發(fā)，期間精子頂體的外膜在與疊加的卵母細胞質膜處多個點上發(fā)生膜融合，釋放出頂體的內(nèi)容物，隨后使卵子分子暴露在頂體的內(nèi)膜上。頂體反應使獲能精子穿越透明帶，從而與卵母細胞受精�！ ‰m然其他信號可能參與了精子的頂體反應，但頂體反應的基本要素是精子細胞內(nèi)鈣離子水平的提高，因為用鈣離子載體處理獲能精子通常足以誘發(fā)胞吐作用。頂體反應的調節(jié)似乎包括壓力門通鈣通道的開放，導致鈣離子暫時性內(nèi)流和細胞內(nèi)鈣離子水平持續(xù)增加。最新的研究表明，鈣離子會直接與精子細胞內(nèi)的膜融合裝置結合，從而引發(fā)頂體反應。精子的頂體反應只有在精子獲能以后才能發(fā)生；因此，授精的前提是這種現(xiàn)象必須發(fā)生在適當?shù)臅r間和部位。
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