離心技術(shù)是將含有微小顆粒的懸浮液置于轉(zhuǎn)頭中,利用轉(zhuǎn)頭繞軸旋轉(zhuǎn)所產(chǎn)生的離心力,將懸浮的微小顆粒按密度或質(zhì)量的差異將其分離的方法。隨著離心技術(shù)的不斷發(fā)展及離心裝置的不斷完善,離心機的最大額定轉(zhuǎn)速不斷提高,經(jīng)歷了低速、高速、超速等發(fā)展階段。離心機的結(jié)構(gòu)也更加復(fù)雜,加入了冷凍系統(tǒng)、真空系統(tǒng)及具有自動控制功能的操作系統(tǒng)等,分析用超速離心機還裝有分析光學(xué)系統(tǒng),可用于樣品的定量分析。電子計算機自動控制程序的引入使得樣品相對分子質(zhì)量、沉降系數(shù)及擴散系數(shù)等的測定自動化,為提高測定速度和測定結(jié)果的準確性提供了有利的條件。
一 基本原理
(一)相對離心力
離心技術(shù)是根據(jù)微小顆粒物質(zhì)在離心場中的行為建立并發(fā)展起來的。離心機的轉(zhuǎn)頭能夠以穩(wěn)定的角速度做圓周運動,從而產(chǎn)生一個強大的輻射向外的離心力場,它賦予處于其中的任何物體一個離心加速度,使之受到一個外向的離心力。離心機所產(chǎn)生的離心場(G),通常以如下方程式表示:
G=ω2r
式中,ω為轉(zhuǎn)頭的角速度,以rad/s表示,r為旋轉(zhuǎn)半徑(物質(zhì)質(zhì)點所處位置與旋轉(zhuǎn)中心的距離)。離心場通常用相對離心力RCF表示,符號FRC,也就是離心力的大小相當于地心引力(即重力加速度g)的倍數(shù)來表示,即:
FRC=ω2r/g
公式進一步推導(dǎo):FRC=1.119×10-5×n2r
式中n為轉(zhuǎn)頭轉(zhuǎn)速,以轉(zhuǎn)/分,簡寫成r/min)表示;g為重力加速度,等于980.6cm/s2.從式中可看出離心機的轉(zhuǎn)頭轉(zhuǎn)速和相對離心力g或×g之間可以互相換算。醫(yī) 學(xué)全,在線.搜集.整理zxtf.net.cn一般在低速離心時(轉(zhuǎn)速小于5000r/min),相對離心力的大小常用r/min來表示,而超速離心時則用×g來表示。
(二)沉降系數(shù)
沉降系數(shù)是指單位離心場作用下顆粒沉降的速度,以S來表示,
S=v/(ω2r)。
當我們對某些生物高分子和亞細胞器組分的化學(xué)結(jié)構(gòu)、相對分子質(zhì)量還不了解時,可以用沉降系數(shù)對它們的物理特性進行初步描述,將它們區(qū)分開來。例如大腸桿菌核蛋白體是70S,它由兩個亞基組成,用超離心的方法測得其沉降系數(shù)分別為30S和50S,當我們還不清楚它們的結(jié)構(gòu)時就暫以30S和50S命名以示區(qū)別。
沉降系數(shù)S的值與顆粒的大小、形狀和密度,以及離心所使用的介質(zhì)的密度和粘度有關(guān),而與轉(zhuǎn)頭的速度和類型無關(guān)。
因為實際測定沉降系數(shù)的條件各不相同,必須進行標準化才能準確地描述顆粒特性。
公認的標準介質(zhì)是20℃的水,它的密度和粘度(ρ20,w,η20,w)是已知的。在這種標準介質(zhì)中所確定的顆粒的沉降系數(shù)只依賴于顆粒本身的兩個參數(shù),即顆粒大小和密度,而這兩個參數(shù)可以用離心的方法確定。顆粒在20℃水中的沉降系數(shù)稱為其沉降常數(shù)S20,w. S20,w與它的測量狀態(tài)無關(guān),因而具有通用的特性。
確定沉降常數(shù)沒有必要一定在水中進行離心。如果已知介質(zhì)的特征值(ρm,ηm),就可利用在該介質(zhì)中離心的數(shù)據(jù)確定沉降系數(shù)S,再將S20,w的表達式除以S的表達式,即可求出顆粒的沉降常數(shù)。
(三)沉降速度
沉降速度是指在強大的離心力作用下,單位時間內(nèi)物質(zhì)顆粒沿半徑方向運動的距離。顆粒沉降速度與下面三方面因素有關(guān):
(1)顆粒本身的性質(zhì) 沉降速度與顆粒直徑和密度成正比。密度相同時大顆粒比小顆粒沉降快;大小相同時,密度大的顆粒比密度小的沉降快。
(2)介質(zhì)的性質(zhì) 沉降速度與介質(zhì)的粘度、密度成反比,介質(zhì)粘度、密度大,則顆粒沉降慢。
(3)離心條件 顆粒沉降速度與離心時轉(zhuǎn)速和旋轉(zhuǎn)半徑成正比。如果其他的條件不變,沉降速度隨著r的增大而增大,在進行速度區(qū)帶離心時,r?qū)Τ两邓俣鹊倪@種影響不利于達到滿意的分離效果,所以需要在沿半徑方向上相應(yīng)地增加介質(zhì)的密度和粘度以克服r的增加造成的影響。
(四)沉降時間
分離某物質(zhì)所需的時間常用反復(fù)多次的實驗來取得。如果已知該物質(zhì)的一些物理特性,也能用沉降時間來計算分離該物質(zhì)所需的分離時間。樣品顆粒完全沉降到管底內(nèi)壁的時間tm,可以下列方程式表示:
tm=(1/S)*( lnx2- lnx1)/ ω2式中,
x2表示旋轉(zhuǎn)中心到離心管底內(nèi)壁的距離;
x1表示旋轉(zhuǎn)中心到樣品溶液彎月面之間的距離
S表示樣品沉降系數(shù)