| 公開(公告)號(hào) | CN100360668C |
| 公開(公告)日 | 2008.01.09 |
| 申請(qǐng)(專利)號(hào) | CN200510025777.4 |
| 申請(qǐng)日期 | 2005.05.12 |
| 專利名稱 | 分泌腫瘤壞死因子－α的重組卡介苗及其構(gòu)建方法 |
| 主分類號(hào) | C12N15/09(2006.01)I |
| 分類號(hào) | C12N15/09(2006.01)I;C12N15/63(2006.01)I;C12N15/28(2006.01)I;C12N15/87(2006.01)I;A61K38/17(2006.01)I;A61K38/19(2006.01)I;A61K39/00(2006.01)I;C12Q1/68(2006.01)I;A61P35/00(2006.01)I;A61P31/06(2006.01)I |
| 分案原申請(qǐng)?zhí)? | |
| 優(yōu)先權(quán) | |
| 申請(qǐng)(專利權(quán))人 | 上海交通大學(xué) |
| 發(fā)明(設(shè)計(jì))人 | 夏術(shù)階;劉海濤;孫曉文 |
| 地址 | 200240上海市閔行區(qū)東川路800號(hào) |
| 頒證日 | |
| 國(guó)際申請(qǐng) | |
| 進(jìn)入國(guó)家日期 | |
| 專利代理機(jī)構(gòu) | 上海交達(dá)專利事務(wù)所 |
| 代理人 | 毛翠瑩 |
| 國(guó)省代碼 | 上海;31 |
| 主權(quán)項(xiàng) | 一種分泌腫瘤壞死因子-α的重組卡介苗的構(gòu)建方法，其特征在于包括下述步驟： 1)卡介苗穿梭表達(dá)載體的構(gòu)建：分別設(shè)計(jì)Ag85B和TNF-α的擴(kuò)增引物，Ag85B信號(hào)肽的上下游酶切位點(diǎn)分別為BamHI和EcorI，TNF-α的上下游酶切位點(diǎn)分別為EcorI和SalI，經(jīng)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)分別合成Ag85B信號(hào)肽和TNF-α基因片段，將Ag85B信號(hào)肽克隆到pMV261載體中，得到pMS，再將TNF-α基因片段與pMS載體的信號(hào)肽連接，得到穿梭表達(dá)載體pMSTNF-α； 2)卡介苗的培養(yǎng)：選取卡介苗為上海丹麥株，將卡介苗放在含有液體培養(yǎng)基的燒瓶中進(jìn)行搖床培養(yǎng)，液體培養(yǎng)基含有10％的營(yíng)養(yǎng)劑ADC、0.5％吐溫80和0.2％甘油，搖床培養(yǎng)100轉(zhuǎn)/分，三周后卡介苗處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，OD600值＝0.6，制得感受態(tài)卡介苗； 3)電轉(zhuǎn)化技術(shù)構(gòu)建分泌人TNF-α的重組卡介苗rBCGTNF-α：在一離心管中混勻400μl含1×108cfu的感受態(tài)卡介苗和2μl含0.4μg的穿梭表達(dá)質(zhì)粒pMSTNF-α，置于基因脈沖儀中進(jìn)行電轉(zhuǎn)化得到陽(yáng)性重組子，電轉(zhuǎn)參數(shù)：電壓為2500V，電流為25μF，電阻為1000Ω，陽(yáng)性重組子先在含有50μg/ml卡那霉素的固體培養(yǎng)基中篩選，培養(yǎng)兩周后得到陽(yáng)性克隆rBCGTNF-α，然后接種在含有50μg/ml卡那霉素的液體培養(yǎng)基搖床生長(zhǎng)，大量培養(yǎng)； 4)重組卡介苗rBCGTNF-α的鑒定與功能檢測(cè)：進(jìn)行Z-N法抗酸染色證實(shí)為抗酸桿菌，抽提rBCGTNF-α質(zhì)粒DNA后，PCR擴(kuò)增得到TNF-α基因片斷，WesternBlot檢測(cè)到rBCGTNF-α培養(yǎng)上清中和菌體中有TNF-α蛋白的表達(dá)，ELISA方法檢測(cè)到rBCGTNF-α培養(yǎng)上清中有高含量的TNF-α。 |
| 摘要 | 本發(fā)明涉及一種分泌腫瘤壞死因子-α的重組卡介苗及其構(gòu)建方法，利用基因工程技術(shù)將起分泌作用的卡介苗Ag85B信號(hào)肽和TNF-α的基因片段克隆至pMV261，得到卡介苗穿梭表達(dá)載體pMSTNF-α，然后采用電轉(zhuǎn)化技術(shù)將pMSTNF-α導(dǎo)入BCG構(gòu)建重組卡介苗rBCGTNF-α，依靠pMSTNF-α在BCG的復(fù)制和信號(hào)肽的分泌作用，能夠高效分泌TNF-α。本發(fā)明得到的重組卡介苗rBCGTNF-α具有BCG和TNF-α的雙重效果，能夠有效預(yù)防和治療淺表性膀胱腫瘤；利用重組卡介苗rBCGTNF-α在膀胱腔內(nèi)的局部協(xié)同作用減少BCG和外用TNF-α的用量，可以克服BCG治療的毒副作用。 |
| 國(guó)際公布 |
