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公開(公告)號
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CN101063124A
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公開(公告)日
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2007.10.31
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申請(專利)號
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CN200710020891.7
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申請日期
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2007.04.17
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專利名稱
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人白介素-11與人血清白蛋白的融合蛋白的制備方法及產(chǎn)品
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主分類號
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C12N15/09(2006.01)I
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分類號
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C12N15/09(2006.01)I;C12N15/62(2006.01)I;C07K19/00(2006.01)I;C12N1/19(2006.01)I
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分案原申請?zhí)? |
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優(yōu)先權(quán)
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申請(專利權(quán))人
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江南大學
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發(fā)明(設(shè)計)人
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李華鐘;金 堅;段作營;孫慧碧;張蓮芬
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地址
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214122江蘇省無錫市蠡湖大道1800號
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頒證日
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國際申請
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進入國家日期
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專利代理機構(gòu)
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無錫市大為專利商標事務所
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代理人
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時旭丹;劉品超
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國省代碼
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江蘇;32
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主權(quán)項
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人白介素-11與人血清白蛋白的融合蛋白的制備方法，其特征是從人骨髓基質(zhì)細胞中分離細胞，提取RNA，通過RT-PCR反轉(zhuǎn)錄擴增得到IL-11cDNA；通過PCR從人胎肝cDNA文庫中擴增獲得HSAcDNA；利用重疊PCR技術(shù)，連接IL-11cDNA和HSAcDNA，中間不加入任何連接肽，得到的HSA-IL-11cDNA融合基因插入到克隆載體；HSA-IL-11cDNA融合基因在宿主系統(tǒng)中進行表達，HSA-IL-11cDNA融合基因被整合到宿主的染色體中； (1)IL-11-cDNA克隆 以RT-PCR反轉(zhuǎn)錄得到的IL-11cDNA第一鏈為模板，通過PCR擴增出IL-11cDNA，所用的引物如下： P1：5’-GTCAAGCTGCCTTAGGCTTACCTGGGCCACCACCTGGCCC-3’ P2：5’-GCGGCCGCTCACAGCCGAGTCTTCAGCAGCAG-3’ PCR方法如下：50μl的反應體系中加入：10μmol/L的P1和P2的引物各1.5μl，2mmol/L的dNTP5μl，10×pfuBuffer5μl，5U/μl的pfuDNA聚合酶0.5μl，IL-11cDNA第一鏈1μg，加雙蒸水補齊50μl，PCR條件為：94℃變性5分鐘，55℃退火30秒，72℃延伸45秒，循環(huán)28次，最后72℃延伸5分鐘； 通過瓊脂糖凝膠電泳分析反應產(chǎn)物，在加樣泳道出現(xiàn)目標條帶，用PCR片段膠回收試劑盒純化出0.5kb的目標片段，對目標片段產(chǎn)物進行T-A克隆到pMD19T-Vector中，重組質(zhì)粒命名為pMD-IL-11； (2)HSA-cDNA的克�。� 利用PCR從人胎肝cDNA文庫中擴增出HSAcDNA，所用的引物為： PH1：5’-AGGTCGACGATGCACACAAGAGTGAGGTTGCTC-3’ PH2：5’-GCCAAGCTTTTATAAGCCTAAGGCAGCTTGACTT-3’ PCR方法如下：50μl的反應體系中加入：10μmol/L的PH1和PH2的引物各1.5μl，2mmol/L的dNTP5μl，10×pfuBuffer1μl，5U/μl的pfuDNA聚合酶0.5μl，人胎肝cDNA文庫1μg，加雙蒸水補齊50μl；PCR條件為：95℃變性5分鐘，94℃變性1分鐘，60℃退火1分鐘，72℃延伸90秒，循環(huán)30次； 通過瓊脂糖凝膠電泳分析反應產(chǎn)物，在加樣泳道出現(xiàn)目標條帶，用PCR片段膠回收試劑盒純化出1.8kb的目標片段，純化好的目標片段和載體pBluescriptIIKS(+)分別經(jīng)SalI和HindIII雙酶切；瓊脂糖凝膠電泳純化，用PCR片段膠回收試劑盒回收，用T4連接酶連接兩雙酶切后純化好的片段；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，轉(zhuǎn)化物涂布于含有X-gal、IPTG和100μg/ml氨芐青霉素的LB瓊脂平板，37℃培養(yǎng)過夜；挑取白色菌落，接種于20ml含100μg/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)過夜，提取質(zhì)粒；通過PCR，及SalI和HindIII雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳鑒定陽性克隆，并對重組質(zhì)粒SalI和HindIII雙酶切位點間區(qū)域進行DNA測序；陽性重組子保存在含有20％甘油的LB中，凍存于-80℃；重組質(zhì)粒命名為pBlue-HSA，陽性重組子命名為DH5α/pBlue-HAS； (3)IL-11-cDNA的擴增： 從pMD-IL-11質(zhì)粒中用PCR的方法擴增，引物如下： IL-3：5’-GTCAAGCTGCCTTAGGCTTACCTGGGCCACCACCTGGCCC-3’ IL-4：5’-GCGGCCGCTCACAGCCGAGTCTTCAGCAGCAG-3’ PCR方法如下：50μl的反應體系中加入：10μmol/L的引物IL-3和引物IL-4各2μl，2mmol/L的dNTP5μl，10×pfuBuffer1μl，5U/μl的pfuDNA聚合酶0.5μl，pMD-IL-11質(zhì)粒1μg，加雙蒸水補齊50μl，PCR條件為：95℃變性5分鐘，94℃變性1分鐘，57℃退火1分鐘，72℃延伸90秒，循環(huán)30次； 通過瓊脂糖凝膠電泳分析反應產(chǎn)物，在加樣泳道出現(xiàn)目標條帶，用PCR片段膠回收試劑盒純化出0.5kb的目標條帶，純化好的目標片段備用； (4)HSAcDNA的PCR擴增，所用的引物為： HI-1：5’-GAATTCGATGCACACAAGAGTGAGGTTG-3’ HI-2：5’-GGGCCAGGTGGTGGCCCAGGTAAGCCTAAGGCAGCTTGAC-3’ PCR方法如下：50μl的反應體系中加入：10μmol/L的引物HI-1和引物HI-2各2μl，2mmol/L的dNTP5μl，10×pfuBuffer1μl，5U/μl的pfuDNA聚合酶0.5μl，pBlue-HAS質(zhì)粒1μg，加雙蒸水補齊50μl；PCR條件為：95℃變性5分鐘，94℃變性1分鐘，60℃退火1分鐘，72℃延伸150秒，循環(huán)30次； 通過瓊脂糖凝膠電泳分析反應產(chǎn)物，在加樣泳道出現(xiàn)目標條帶，用PCR片段膠回收試劑盒純化出1.8kb的目標條帶，純化好的目標片段備用； (5)HSAcDNA和IL-11cDNA的連接： 利用重疊PCR融合IL-11cDNA和HSAcDNA，將IL-11cDNA的PCR擴增產(chǎn)物純化后和HAScDNA的PCR擴增產(chǎn)物純化后按照1∶1的體積比混合后作為模板，于50μl的反應體系中加入：2mmol/L的dNTP5μl，10×TaqBuffer5μl，5U/μl的TaqDNA聚合酶0.5μl，混合好的模板1μl，加雙蒸水補齊45μl；PCR條件為：95℃變性5分鐘，94℃變性1分鐘，60℃退火1分鐘，72℃延伸3分鐘，循環(huán)10次后，向反應體系中加入10μmol/L的HI-1和IL-4的引物各2.5μl，繼續(xù)做30次上述循環(huán)； 通過瓊脂糖凝膠電泳分析反應產(chǎn)物，在加樣泳道出現(xiàn)目標條帶，用PCR片段膠回收試劑盒純化出2.3kb的目標條帶，純化好的目標片段HSA-IL-11cDNA，再EcoRI和NotI雙酶切純化好的片段和載體pMD19-T按照1∶7的體積比用T4連接酶連接；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌XL-1Blue感受態(tài)細胞，轉(zhuǎn)化物涂布于含有X-gal、IPTG和10
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摘要
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人白介素-11(IL-11)與人血清白蛋白(HSA)的融合蛋白的制備方法及產(chǎn)品，屬于長效重組融合蛋白藥物技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明利用重疊PCR技術(shù)，連接IL-11cDNA和HSA cDNA，中間不加入任何連接肽，得到的HSA-IL-11cDNA融合基因被整合到宿主的染色體中，在宿主系統(tǒng)中進行表達。本發(fā)明的融合蛋白包括與人血清白蛋白至少85％序列同源的第一區(qū)和與人白介素-11至少85％序列同源的第二區(qū)，兩區(qū)直接連接，中間不加入任何連接肽，該融合蛋白可以在不改變?nèi)诤系鞍滋匦缘那疤嵯�，進行個別氨基酸殘基的取代、缺失或加入。本發(fā)明的融合蛋白在保持了人白介素-11的生理特性的基礎(chǔ)上，延長其在體內(nèi)的半衰期，改善其溶解度，在藥學領(lǐng)域有良好的應用前景。
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國際公布
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