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公開(公告)號
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CN101037477A
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公開(公告)日
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2007.09.19
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申請(專利)號
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CN200710020034.7
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申請日期
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2007.02.08
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專利名稱
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人血清白蛋白與人粒細(xì)胞集落刺激因子的融合蛋白的制備方法及產(chǎn)品
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主分類號
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C07K19/00(2006.01)I
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分類號
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C07K19/00(2006.01)I;C12N15/09(2006.01)I;C12N15/62(2006.01)I;C12N1/19(2006.01)I
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分案原申請?zhí)? |
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優(yōu)先權(quán)
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申請(專利權(quán))人
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江南大學(xué)
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發(fā)明(設(shè)計(jì))人
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金 堅(jiān);張蓮芬;徐 鈺;許正宏;雷楗勇;竇文芳;史仲平
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地址
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214122江蘇省無錫市蠡湖大道1800號
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頒證日
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國際申請
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進(jìn)入國家日期
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專利代理機(jī)構(gòu)
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無錫市大為專利商標(biāo)事務(wù)所
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代理人
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時(shí)旭丹;劉品超
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國省代碼
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江蘇;32
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主權(quán)項(xiàng)
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人血清白蛋白與人粒細(xì)胞集落刺激因子的融合蛋白的制備方法，其特征是從新鮮人外周血中分離單核淋巴細(xì)胞，刺激培養(yǎng)，提取RNA，通過RT-PCR反轉(zhuǎn)錄得到G-CSFcDNA；通過PCR從人胎肝cDNA文庫中擴(kuò)增獲得HSAcDNA；利用重疊PCR技術(shù)，連接HSAcDNA和G-CSFcDNA，中間不加入任何連接肽，得到的HSA-GCSFcDNA融合基因插入到克隆載體，HSA-GCSFcDNA融合基因在宿主系統(tǒng)進(jìn)行表達(dá)，HSA-GCSFcDNA融合基因被整合到宿主的染色體中； (1)G-CSFcDNA的克�。� 以反轉(zhuǎn)錄PCR得到的G-CSFcDNA第一鏈為模板，通過PCR擴(kuò)增出G-CSFcDNA，所用的引物如下： p1：5’-CGGAATTCATGACCCCCCTGGGCCCTGC-3’ p2：5’-CGGCGGCCGCTCAGGGCTGGGCAAGGTGGC-3’ PCR方法如下：50μl的反應(yīng)體系中加入：10μmol/L的p1和p2的引物各1.5μl，2mmol/L的dNTP5μl，10×pfuBuffer5μl，5U/μl的pfuDNA聚合酶0.5μl，G-CSFcDNA第一鏈1μg，加雙蒸水補(bǔ)齊50μl，PCR條件為：95℃變性10分鐘，94℃變性1分鐘，66.5℃退火1分鐘，72℃延伸90秒，循環(huán)35次； 通過瓊脂糖凝膠電泳分析反應(yīng)產(chǎn)物，在加樣泳道出現(xiàn)目標(biāo)條帶，用PCR片段膠回收試劑盒純化出0.5kb的目標(biāo)片段，純化好的目標(biāo)片段和載體pBluescriptIIKS(+)分別經(jīng)EcoRI和NotI雙酶切；瓊脂糖凝膠電泳純化，用PCR片段膠回收試劑盒回收，用T4連接酶連接兩雙酶切后純化好的片段；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化物涂布于含有X-gal、IPTG和100μg/ml氨芐青霉素的LB瓊脂平板，37℃培養(yǎng)過夜；挑取白色菌落，接種于20ml含100μg/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)過夜，提取質(zhì)粒；通過PCR，及EcoRI和NotI雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳鑒定陽性克隆，并對重組質(zhì)粒EcoRI和NotI雙酶切位點(diǎn)間區(qū)域進(jìn)行DNA測序；陽性重組子保存在含有20％甘油的LB中，凍于-80℃；重組質(zhì)粒命名為pBlue-GCSF，陽性重組子命名為DH5α/pBlue-GCSF； (2)HSAcDNA的克�。� 利用PCR從人胎肝cDNA文庫中擴(kuò)增出HSAcDNA，所用的引物為： PH1：5’-AGGTCGACGATGCACACAAGAGTGAGGTTGCTC-3’ PH2：5’-GCCAAGCTTTTATAAGCCTAAGGCAGCTTGACTT-3’ PCR方法如下：50μl的反應(yīng)體系中加入：10μmol/L的PH1和PH2的引物各1.5μl，2mmol/L的dNTP5μl，10×pfuBuffer1μl，5U/μl的pfuDNA聚合酶0.5μl，人胎肝cDNA文庫1μg，加雙蒸水補(bǔ)齊50μl；PCR條件為：95℃變性5分鐘，94℃變性1分鐘，60℃退火1分鐘，72℃延伸90秒，循環(huán)30次； 通過瓊脂糖凝膠電泳分析反應(yīng)產(chǎn)物，在加樣泳道出現(xiàn)目標(biāo)條帶，用PCR片段膠回收試劑盒純化出1.8kb的目標(biāo)片段，純化好的目標(biāo)片段和載體pBlue分別經(jīng)SalI和HindIII雙酶切；瓊脂糖凝膠電泳純化，用PCR片段膠回收試劑盒回收，用T4連接酶連接兩雙酶切后純化好的片段；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化物涂布于含有X-gal、IPTG和100μg/ml氨芐青霉素的LB瓊脂平板，37℃培養(yǎng)過夜；挑取白色菌落，接種于20ml含100μg/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)過夜，提取質(zhì)粒；通過PCR，及SalI和HindIII雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳鑒定陽性克隆，并對重組質(zhì)粒SalI和HindIII雙酶切位點(diǎn)間區(qū)域進(jìn)行DNA測序；陽性重組子保存在含有20％甘油的LB中，凍于-80℃；重組質(zhì)粒命名為pBlue-HSA，陽性重組子命名為DH5α/pBlue-HSA； (3)HSAcDNA和G-CSFcDNA融合基因的克隆： HSAcDNA的PCR擴(kuò)增，所用引物如下： P1：5’-CGGAATTCAAAAGAGATGCACACAAGAGTGAGGTTGCTCATCG-3’ P2：5’-CAGGGGGGTGCCTAAGGCAGCTTGACTTGCAGCAACAA-3’ PCR方法如下：50μl的反應(yīng)體系中加入：10μmol/L的引物P1和P2各1.5μl，2mmol/L的dNTP5μl，10×pfuBuffer5μl，5U/μl的pfuDNA聚合酶0.5μl，pBlue-HSA1μg，加雙蒸水補(bǔ)齊50μl；PCR條件為：95℃變性5分鐘，65℃退火1分鐘，72℃延伸4分鐘，94℃變性1分鐘，循環(huán)30次； G-CSFcDNA的PCR擴(kuò)增，所用引物如下： P3：5’-CTGCCTTAGGCACCCCCCTGGGCCCTG-3’ P4：5’-CGGCGGCCGCTCAGGGCTGGGCAAGGTGGCGTAGAAC-3’ PCR方法如下：50μl的反應(yīng)體系中加入：10μmol/L的P3和P4的引物各1.5μl，2mmol/L的dNTP5μl，10×pfuBuffer5μl，5U/μl的pfuDNA聚合酶0.5μl，pBlue-GCSF1μg，加雙蒸水補(bǔ)齊50μl；PCR條件為：95℃變性5分鐘，66.5℃退火1分鐘，72℃延伸90秒，94℃變性1分鐘，循環(huán)30次； 利用重疊PCR融合G-CSFcDNA和HSAcDNA： 將G-CSF的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和HSA的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分別稀釋10倍，再以4∶6比例混合后作為模板，于50μl的反應(yīng)體系中加入：2mmol/L的dNTP5μl，10×pfuBuffer5μl，5U/μl的pfuDNA聚合酶0.5μl，混合好的模板1μl，加雙蒸水補(bǔ)齊50μl；PCR條件為：95℃變性5分鐘，60.5℃退火1分鐘，72℃延伸4分鐘，94℃變性1分鐘，循環(huán)30次； 通過瓊脂糖凝膠電泳分析反應(yīng)產(chǎn)物，在加樣泳道出現(xiàn)目標(biāo)條帶
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摘要
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人血清白蛋白與人粒細(xì)胞集落刺激因子的融合蛋白的制備方法及產(chǎn)品，屬于長效融合蛋白藥物技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明利用重疊PCR技術(shù)，將HSA基因cDNA和G-CSF cDNA進(jìn)行拼接，中間不加入任何連接肽，得到的HSA-GCSF cDNA融合基因在宿主系統(tǒng)中進(jìn)行表達(dá)，融合基因被整合到宿主的染色體中；本發(fā)明的融合蛋白包括與人血清白蛋白至少85％序列同源的第一區(qū)和與人粒細(xì)胞集落刺激因子至少85％序列同源的第二區(qū)，該融合蛋白可以在不改變?nèi)诤系鞍滋匦缘那疤嵯�，進(jìn)行個(gè)別氨基酸殘基的取代、缺失或加入；宿主系統(tǒng)可以是細(xì)菌、酵母、昆蟲細(xì)胞、動(dòng)物細(xì)胞、植物細(xì)胞等。本發(fā)明的融合蛋白在保持了人粒細(xì)胞集落刺激因子的生理特性的基礎(chǔ)上延長其在體內(nèi)的半衰期，在藥學(xué)領(lǐng)域有良好的應(yīng)用前景。
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國際公布
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