| 公開(公告)號(hào) | CN101016536A |
| 公開(公告)日 | 2007.08.15 |
| 申請(專利)號(hào) | CN200610135351.9 |
| 申請日期 | 2006.12.21 |
| 專利名稱 | 乙型肝炎病毒細(xì)胞株HepG2-RHBV的構(gòu)建 |
| 主分類號(hào) | C12N5/10(2006.01)I |
| 分類號(hào) | C12N5/10(2006.01)I;C12N15/09(2006.01)I;C12N15/51(2006.01)I;C12N15/79(2006.01)I;G01N33/53(2006.01)I;C12Q1/68(2006.01)I;C12Q1/04(2006.01)I |
| 分案原申請?zhí)? | |
| 優(yōu)先權(quán) | |
| 申請(專利權(quán))人 | 福建醫(yī)科大學(xué) |
| 發(fā)明(設(shè)計(jì))人 | 林 旭;黃清玲;柏世玉;林建銀 |
| 地址 | 350004福建省福州市交通路88號(hào)福建醫(yī)科大學(xué) |
| 頒證日 | |
| 國際申請 | |
| 進(jìn)入國家日期 | |
| 專利代理機(jī)構(gòu) | |
| 代理人 | |
| 國省代碼 | 福建;35 |
| 主權(quán)項(xiàng) | 一種乙型肝炎病毒細(xì)胞株HepG2-RHBV的構(gòu)建，其特征是： (一)試劑： p56為pUC18重組載體，含全基因組HBV DNA，HBV DNA的preS2起始密碼由CTG定點(diǎn)突變成ATG；HepG2細(xì)胞及HepG2.2.15細(xì)胞，均以含10％小牛血清的DMEM培養(yǎng)； (二)構(gòu)建1.2倍體HBV DNA重組真核表達(dá)載體 (1)片段A的獲取 以引物TBf和TBr從質(zhì)粒pSEAP2-Basic中擴(kuò)增0.1Kb的TB片段Transcription Blocker，總體積為50ul，用ABI 9700 PCR擴(kuò)增儀擴(kuò)增，采用熱啟動(dòng)方式，待溫度上升至94℃后加入聚合酶，反應(yīng)經(jīng)94℃預(yù)變性2分鐘后進(jìn)入循環(huán)，循環(huán)結(jié)束后72℃延伸7分鐘；PCR產(chǎn)物與0.2倍體積的6×DNA上樣緩沖液混勻后上樣，1.5％瓊脂糖凝膠，0.5×TBE電泳緩沖液，穩(wěn)壓120V，電泳30分鐘；在紫外燈下將含目的基因片段的瓊脂糖凝膠切下，置離心管中，用膠回收試劑盒回收DNA片段，每100mg瓊脂糖凝膠加入300μl Solution I，65℃水浴10分鐘，每隔兩分鐘顛倒一次，使膠完全溶解；混合液移入吸附柱中，10000g離心1分鐘，棄去收集管中的液體；吸附柱中加入500μl Solution II，10000g離心1分鐘，棄去收集管中的液體；再以solution II液重復(fù)洗柱一次；空柱10000g離心2分鐘，將吸附柱置1.5ml離心管中，開蓋放置2分鐘使乙醇完全揮發(fā)，往吸附柱中央加入25μl滅菌雙蒸水，室溫靜置5分鐘后10000g離心1分鐘洗脫DNA； PCR回收產(chǎn)物以Sal I、BamH I酶切，反應(yīng)體系20μl，37℃水浴16h，酶消化產(chǎn)物經(jīng)1.5％瓊脂糖凝膠電泳后回收，該片段記為A； (2)片段B的獲取 以Sap I完全酶切p56-mut，反應(yīng)體系100μl，37℃水浴16h，酶消化產(chǎn)物經(jīng)0.75％瓊脂糖凝膠電泳后回收3.2kb的片段即完整的全基因組HBV DNA；回收產(chǎn)物進(jìn)行自身連接，反應(yīng)體系20μl，4℃連接24h，連接產(chǎn)物用DNA純化試劑盒純化，加入250μl Solution I，混合液移入吸附柱中，10000g離心1分鐘，棄去收集管中的液體；吸附柱中加入500μl Solution II，10000g離心1分鐘，棄去收集管中的液體；再以solution II液重復(fù)洗柱一次；空柱10000g離心2分鐘，將吸附柱置1.5ml離心管中，開蓋放置3分鐘使乙醇完全揮發(fā)，往吸附柱中央加入25μl滅菌雙蒸水，室溫靜置5分鐘后10000g離心1分鐘洗脫DNA；獲得的環(huán)狀HBV DNA記為#56-mut HBV DNA，以BamH I和Xba I雙酶切，反應(yīng)體積20μl，37℃水浴16h，酶消化產(chǎn)物經(jīng)1.0％瓊脂糖凝膠電泳后回收約2.0Kb片段，該片段記為B； (3)片段C的獲取 以Xba I和Rsr II雙酶切p56-mut，反應(yīng)體積20μl，37℃水浴16h，酶消化產(chǎn)物經(jīng)1.0％瓊脂糖凝膠電泳后膠回收試劑盒回收1.3Kb片段，該片段記為C； (4)片段D的獲取 用引物PC和PD從#56-mut HBV DNA中擴(kuò)增0.6Kb DNA，總體積為50ul；PCR擴(kuò)增條件同前，1.5％瓊脂糖凝膠電泳后膠回收試劑盒回收約0.6Kb片段，并以Rsr II酶切，反應(yīng)體積20μl；37℃水浴16h，酶消化產(chǎn)物經(jīng)DNA純化試劑盒純化，純化產(chǎn)物用SalI酶切，反應(yīng)體積20μl；37℃水浴16h，酶消化產(chǎn)物經(jīng)1.0％瓊脂糖凝膠電泳后膠回收試劑盒回收約0.4Kb片段，該片段記為D； (5)pREP10載體的酶切 以Sal I切除pREP10載體上的真核表達(dá)盒相關(guān)片段，包括CMV啟動(dòng)子、多克隆位點(diǎn)、SV40加尾信號(hào)，反應(yīng)體積20μl；37℃水浴16h，酶消化產(chǎn)物經(jīng)0.75％瓊脂糖凝膠電泳后膠回收試劑盒回收約8.2Kb載體片段； (6)目的片段與載體的連接及轉(zhuǎn)化 以Sal I切除pREP10載體后回收的8.2Kb載體片段與A-D四個(gè)片段連接，構(gòu)建重組載體pREP-HBV，反應(yīng)體積30μl，4℃連接24h，將連接產(chǎn)物加入100μl感受態(tài)Top10細(xì)菌，冰浴30分鐘，42℃熱休克2分鐘，快速置冰浴2分鐘，加入0.8ml LB培養(yǎng)液，37℃、300rpm/分鐘搖育45分鐘；4000g離心2分鐘收集細(xì)菌，將細(xì)菌涂布于含100μg/ml氨芐青霉素的瓊脂平板上，置于37℃溫箱孵育16小時(shí)； (7)篩選重組克隆 氨芐青霉素瓊脂平板上挑取菌落，轉(zhuǎn)種于5ml含100μg/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液中，37℃、300rpm/分鐘搖育8小時(shí)；取1.5ml菌液用質(zhì)粒小量抽提試劑盒提取質(zhì)粒，4000g離心2分鐘收集細(xì)菌，加入250μl Solution I(25mM Tis-HCl，pH 8.0，10mM EDTA)震蕩重懸細(xì)菌，加入250μl Solution II(0.2N NaOH，1％SDS)，顛倒混勻至菌液變清，加入350μl Solution III(3M KAc，pH5.5)，混勻；12000g離心10分鐘，上清移入吸附柱內(nèi)，12000g離心1分鐘，棄收集管內(nèi)的液體，加入500μl SolutionIV，12000g離心1分鐘，棄收集管內(nèi)的液體，加入650μl SolutionV，10000g離心1分鐘，棄收集管內(nèi)的液體，同法重復(fù)洗柱一次，棄收集管內(nèi)的液體，空柱12000g離心2分鐘；在吸附柱中央加入30μl滅菌三蒸水，12000g離心1分鐘洗脫質(zhì)粒DNA，該質(zhì)粒記為pREP-HBV； pREP-HBV質(zhì)粒含A-D四個(gè)外源DNA片段：A為擴(kuò)增自pSEAP2-Basic載體的TB(Transcription Blocker)片段；B、C、D共同組成1.2倍體HBV DNA，由此構(gòu)成一個(gè)完整的HBV轉(zhuǎn)錄單位，其中B片段位于HBV基因組1402nt-249nt，其5’端含HBV的核心啟動(dòng)子(Basic Core promoter，BCP)，C片段位于HBV基因組249nt-1573nt，D片段位于HBV基因組1573nt-2000nt，其3’端含加尾信號(hào)；取5 |
| 摘要 | 本發(fā)明公開了一種乙型肝炎病毒細(xì)胞株HepG2-RHBV的構(gòu)建，屬人體疾病的預(yù)防與治療的前期研究。本發(fā)明構(gòu)建能穩(wěn)定表達(dá)HBV相關(guān)抗原并復(fù)制的HepG2細(xì)胞株，作為模板的HBV DNA以重組DNA方式游離于細(xì)胞染色體外；以HepG2-RHBV細(xì)胞株應(yīng)用于抗HBV藥物的篩選；以構(gòu)建的HepG2-RHBV細(xì)胞株為基礎(chǔ)，進(jìn)一步研究HBV對HepG2細(xì)胞的影響。由于本發(fā)明構(gòu)建HBV自主復(fù)制的肝細(xì)胞株，使HBV在HepG2細(xì)胞中不僅能長期復(fù)制、表達(dá)特異性抗原及產(chǎn)生病毒顆粒，而且作為模板的HBV DNA以重組DNA方式游離于細(xì)胞染色體外，從而研究HBV對HepG2細(xì)胞的總體影響，分析HBV的可能致病機(jī)制，為臨床治療提供指導(dǎo)和依據(jù)。 |
| 國際公布 |
