| 公開(公告)號 | CN1126818C |
| 公開(公告)日 | 2003.11.05 |
| 申請(專利)號 | CN00109602.8 |
| 申請日期 | 2000.06.16 |
| 專利名稱 | 一種栝樓毛狀根誘導(dǎo)和培養(yǎng)生產(chǎn)核酸抑制蛋白的方法 |
| 主分類號 | C12P21/00 |
| 分類號 | C12P21/00;C12N1/20;C12N5/04;C07K14/415 |
| 分案原申請?zhí)? | |
| 優(yōu)先權(quán) | |
| 申請(專利權(quán))人 | 清華大學(xué) |
| 發(fā)明(設(shè)計(jì))人 | 郭志剛 |
| 地址 | 100084北京市海淀區(qū)清華園 |
| 頒證日 | |
| 國際申請 | |
| 進(jìn)入國家日期 | |
| 專利代理機(jī)構(gòu) | 北京清亦華專利事務(wù)所 |
| 代理人 | 羅文群 |
| 國省代碼 | 北京;11 |
| 主權(quán)項(xiàng) | 一種栝樓毛狀根誘導(dǎo)和培養(yǎng)生產(chǎn)核酸抑制蛋白的方法，其特征在于，該方法包括以下各步驟：(1)在每升MS植物培養(yǎng)基上加入20g/l蔗糖和8g/l瓊脂，在125℃，0.1mPa壓力下消毒15-18分鐘，經(jīng)冷卻后作成平板培養(yǎng)基；(2)將栝樓種子用乙醇和次氯酸鈉消毒后，接種在第1步的培養(yǎng)基上，于20-25℃，用日光燈照射，亮度為1000-3000lx，每日光照12-16小時培養(yǎng)20-30天，種子萌芽長成無菌植株備用；(3)在每升LB細(xì)菌培養(yǎng)基上加入10g/l瓊脂，經(jīng)125℃，0.1mPa壓力下消毒15-18分鐘，經(jīng)冷卻后作成斜面培養(yǎng)基；(4)將發(fā)根農(nóng)桿菌LBA9402菌接種在第3步的培養(yǎng)基上，在35-37℃，避光條件下培養(yǎng)3天，將細(xì)菌活化；(5)將第2步培養(yǎng)出的無菌植株，從每個節(jié)間留下2枚葉片剪斷，作成外殖體，并且在節(jié)位處涂上LBA9402細(xì)菌，用接種針刺傷沾菌的節(jié)位處，然后接種在第1步的培養(yǎng)基上，在20-25℃，日光燈下，強(qiáng)度為500-1000lx，培養(yǎng)10-30天，從被刺傷的節(jié)位處形成不定根；(6)在每升MS植物培養(yǎng)基上加入蔗糖20g/l和氨卞青霉素30-150mg/l制成殺菌培養(yǎng)基，將第5步形成的不定根剪下，放在殺菌培養(yǎng)基內(nèi)，培養(yǎng)3-10天，更換同樣的殺菌培養(yǎng)基內(nèi)反復(fù)除菌培養(yǎng)2-5次，徹底除掉細(xì)菌后，轉(zhuǎn)接在第1步的培養(yǎng)基內(nèi)篩選生長速度最快的根系；(7)在每升MS植物培養(yǎng)基中加入20g/l蔗糖，制成培養(yǎng)液，加入篩選出的毛狀根，在20-25℃，日光燈照射，光強(qiáng)為500-1500lx，在轉(zhuǎn)速為90-150rmp的搖床上，培養(yǎng)15-25天，獲得50-100倍重量的毛狀根；(8)在生物反應(yīng)器內(nèi)，加入第7步的培養(yǎng)液，再添加維生素、氨基酸、誘導(dǎo)子，經(jīng)高溫滅菌處理后，按照培養(yǎng)液重量的2-10％接種上第8步的毛狀根，在20-25℃，弱光或黑暗條件下培養(yǎng)15-30天，就會獲得50-100倍重量的毛狀根；(9)將毛狀根經(jīng)冷凍后進(jìn)行破碎處理，然后在4℃低溫下提取和分離蛋白質(zhì)，經(jīng)過純化處理即獲得26kd、27kd和29kd的核酸抑制蛋白。 |
| 摘要 | 本發(fā)明涉及一種栝樓毛狀根誘導(dǎo)和培養(yǎng)生產(chǎn)核酸抑制蛋白的方法，首先在植物培養(yǎng)基上加入蔗糖和瓊脂制成培養(yǎng)基，將栝樓種子接種在培養(yǎng)基上，將發(fā)根農(nóng)桿菌接種在培養(yǎng)基上，使細(xì)菌活化，將栝樓種子的無菌植株作成外殖體，接種針刺傷沾菌的節(jié)位處，從節(jié)位處形成不定根，將其接種在營養(yǎng)液中得到毛狀根，經(jīng)純化處理即獲得核酸抑制蛋白。本發(fā)明的方法培養(yǎng)毛狀根，其產(chǎn)量可以達(dá)到200-300g/L/20日，其中核酸抑制蛋白含量達(dá)到0.5-1.0‰。 |
| 國際公布 |
