| 公開(公告)號(hào) | CN1468953A |
| 公開(公告)日 | 2004.01.21 |
| 申請(qǐng)(專利)號(hào) | CN02136853.8 |
| 申請(qǐng)日期 | 2002.09.06 |
| 專利名稱 | 人γ-干擾素在畢赤酵母菌中的高效表達(dá)、發(fā)酵和純化 |
| 主分類號(hào) | C12N1/19 |
| 分類號(hào) | C12N1/19;C12N15/81;C12N15/23;C12P21/00 |
| 分案原申請(qǐng)?zhí)? | |
| 優(yōu)先權(quán) | |
| 申請(qǐng)(專利權(quán))人 | 上海擎天生物制藥技術(shù)開發(fā)有限公司 |
| 發(fā)明(設(shè)計(jì))人 | 陳國(guó)富 |
| 地址 | 200000上海市浦東張江高科技園區(qū)郭守敬路351號(hào)2號(hào)樓624－6室 |
| 頒證日 | |
| 國(guó)際申請(qǐng) | |
| 進(jìn)入國(guó)家日期 | |
| 專利代理機(jī)構(gòu) | 上海開祺專利代理有限公司 |
| 代理人 | 費(fèi)開逵 |
| 國(guó)省代碼 | 上海;31 |
| 主權(quán)項(xiàng) | 一種由基因工程菌發(fā)酵制備人γ-干擾素的方法其特征在于基因結(jié)構(gòu)如下的人γ-干擾素基因序列，ATG CAA GAC CCA TAC GTC AAG GAG GCA GAA AAC TTG AAG AAA TAT TTT AAC GCT GGT CAT M Q D P Y V K E A E N L K K Y F N A G HTCT GAC GTG GCA GAC AAT GGA ACA TTA TTT TTG GGT ATT TTG AAG AAC TGG AAA GAA GAG S D V A D N G T L F L G I L K N W K E ETCA GAT AGA AAG ATT ATG CAA TCC CAG ATC GTC TCC TTC TAC TTC AAG CTT TTC AAG AAC S D R K I M Q S Q I V S F Y F K L F K NTTC AAA GAT GAT CAA TCC ATC CAA AAA TCC GTT GAG ACA ATC AAA GAG GAT ATG AAT GTC F K D D Q S I Q K S V E T I K E D M N VAAG TTC TTT AAC TCT AAT AAG AAG AAG CGT GAT GAC TTT GAG AAG TTG ACC AAT TAC TCA K F F N S N K K K R D D F E K L T N Y SGTT ACA GAC TTG AAT GTC CAA CGT AAG GCA ATC CAC GAG CTG ATT CAA GTG ATG GCA GAA V T D L N V Q R K A I H E L I Q V M A ECTT TCT CCA GCT GCT AAA ACC GGA AAG AGA AAG AGG TCT CAA ATG TTG TTT AGA GGA AGA L S P A A K T G K R K R A Q M L F R G RCGT GCT TCT CAA TAG R A S Q Term克隆插入帶有甲醇調(diào)節(jié)型啟動(dòng)子(AOX1)的載體pPIC 3.5K中，獲得表達(dá)載體pPIC3.5K-ifn，采用蛋白酶缺陷的SMD1163畢赤酵母菌為宿主，用G418抗性濃度遞增法篩選多拷貝克隆，得高表達(dá)畢赤酵母株P(guān)ichiaPastoris SMD1163(pPIC 3.5K-ifn，his4 pep4 △prb1)-181(菌種保藏號(hào)為CGMCC NO.0758，菌種保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心)，經(jīng)發(fā)酵，純化得人γ-干擾素。 |
| 摘要 | 設(shè)計(jì)并人工合成了特別適合于畢赤酵母菌(Pichia pastoris)中表達(dá)的人γ-干擾素的基因序列，構(gòu)建了胞內(nèi)表達(dá)人γ-干擾素蛋白的載體pPIC 3.5K-ifn，采用蛋白酶缺陷的SMD1163畢赤酵母菌(Pichia pastoris)為宿主菌，用G418抗性濃度遞增法篩選多拷貝克隆，得高表達(dá)克隆株P(guān)ichia pastorisSMD 1163(pPIC 3.5K-ifn，his4 pep4 Δprb1)-181.該菌在28-30℃不含甲醇的培養(yǎng)基培養(yǎng)48小時(shí)，再在含1％的甲醇的誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)36-48小時(shí)，γ-干擾素表達(dá)量可達(dá)菌體總蛋白的25％。每升含γ-干擾素初品約為1克左右。經(jīng)DEAE-Sepharose凝膠吸附，Sephacryl S-200分子篩層析，DEAE-Sepharose陰離子交換層析，CM-Sepharose陽(yáng)離子交換層析，得純度為97.5％以上(HPLC)的人γ-干擾素蛋白。 |
| 國(guó)際公布 |
