| 公開(公告)號 | CN1580278A |
| 公開(公告)日 | 2005.02.16 |
| 申請(專利)號 | CN03132206.9 |
| 申請日期 | 2003.07.31 |
| 專利名稱 | NF－κB檢測雙鏈DNA微陣列芯片及制備 |
| 主分類號 | C12Q1/68 |
| 分類號 | C12Q1/68 |
| 分案原申請?zhí)? | |
| 優(yōu)先權(quán) | |
| 申請(專利權(quán))人 | 王進科;李同祥;陸祖宏;南京新益華集團有限公司 |
| 發(fā)明(設(shè)計)人 | 王進科;李同祥;陸祖宏 |
| 地址 | 210096江蘇省南京市文昌街2號八舍514室 |
| 頒證日 | |
| 國際申請 | |
| 進入國家日期 | |
| 專利代理機構(gòu) | |
| 代理人 | |
| 國省代碼 | 江蘇;32 |
| 主權(quán)項 | 一種檢測核因子-κB(NuclearFactor-κB，NF-κB)的雙鏈DNA微陣列芯片(double-strandedDNAmicroarraychip，dsDNAmicroarraychip)及其制備(Fabrication)方法，其特征在于該微陣列芯片具有如下結(jié)構(gòu)、功能及制備特征：(a)NF-κB檢測dsDNA微陣列芯片的結(jié)構(gòu)特征：NF-κB檢測dsDNA微陣列芯片由固相支持物及固定在固相支持物表面的dsDNA微陣列構(gòu)成，該dsDNA微陣列由大量固定在固相支持物表面的dsDNA探針分子文庫(library)組成，文庫中不同的dsDNA探針分子上有DNA序列不同的NF-κB轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(DNA-bindingsites)。(b)NF-κB檢測dsDNA微陣列芯片的功能特征：NF-κB檢測dsDNA微陣列芯片可以依靠序列特異性DNA結(jié)合蛋白NF-κB轉(zhuǎn)錄因子與芯片dsDNA探針分子上NF-κB的DNA結(jié)合位點發(fā)生結(jié)合反應(yīng)，實現(xiàn)對被檢測物中NF-κB蛋白的高通量檢測，發(fā)揮多項生物功能，包括：①確定特定細胞核抽提物或溶液中不同NF-κB/Re1家族蛋白包括Re1A/p65、Re1B、c-Re1、NF-κB1/p50和NF-κB2/p52的表達種類；②確定特定細胞核抽提物或溶液中不同NF-κB/Re1家族蛋白如Re1A/p65、Re1B、c-Re1、NF-κB1/p50和NF-κB2/p52的表達水平和活化程度；③確定不同NF-κB/Re1家族蛋白與大量突變型及野生型dsDNA靶點的相互作用的特異性與親合性特征；④確定NF-κB/Re1蛋白與大量突變型及野生型dsDNA靶點相互作用的堿基和氨基酸鍵合規(guī)律；⑤確定NF-κB/Re1蛋白dsDNA結(jié)合靶點的堿基組成矩陣(matrix)，預(yù)測新的NF-κB/Re1蛋白dsDNA結(jié)合靶點，并從全基因組DNA序列中搜索預(yù)測的新的NF-κB/Re1蛋白dsDNA結(jié)合靶點，尋找這些dsDNA結(jié)合靶點的上、下游基因，研究這些基因是否受到NF-κB/Re1蛋白的表達調(diào)控，從而鑒定新的NF-κB/Re1蛋白調(diào)控基因；⑥通過鑒定新的NF-κB/Re1蛋白調(diào)控基因，并結(jié)合已知的NF-κB/Re1蛋白調(diào)控基因，構(gòu)建全基因組NF-κB/Re1蛋白基因表達調(diào)控網(wǎng)絡(luò)；⑦篩選NF-κB/Re1蛋白dsDNA靶點序列特異性結(jié)合組合化學(xué)分子及天然生物分子；⑧篩選NF-κB/Re1蛋白與dsDNA靶點相互作用干預(yù)性組合化學(xué)分子及天然生物分子。(c)NF-κB檢測dsDNA微陣列芯片的制備方法：NF-κB檢測dsDNA微陣列芯片的制備方法包括如下9種：①固相化學(xué)合成兩條堿基序列完全互補的寡核苷酸，其中寡核苷酸上嵌合NF-κB結(jié)合位點，通過液相復(fù)性成為雙分子(bimolecular)雙鏈寡核苷酸，再點樣連接固定到固相基質(zhì)表面，形成NF-κB檢測dsDNA微陣列芯片(雙分子寡核苷酸復(fù)性點樣法)；②固相化學(xué)合成兩條堿基序列完全互補的寡核苷酸，其中寡核苷酸上嵌合NF-κB結(jié)合位點，先將其中化學(xué)修飾的一條寡核苷酸點樣連接固定到固相基質(zhì)表面，形成單鏈DNA微陣列芯片，再用互補的另一條寡核苷酸雜交復(fù)性成為雙分子(bimolecular)雙鏈寡核苷酸，形成NF-κB檢測dsDNA微陣列芯片(雙分子寡核苷酸點樣復(fù)性法)；③固相化學(xué)合成兩條寡核苷酸，其中一條較長寡核苷酸上嵌合NF-κB結(jié)合位點，另一條較短的寡核苷酸作為通用引物，先將化學(xué)修飾的較長寡核苷酸點樣連接固定到固相基質(zhì)表面，形成單鏈DNA微陣列芯片，再與通用引物寡核苷酸雜交復(fù)性成為部分雙分子(partialbimolecular)雙鏈寡核苷酸，再用DNA聚合酶進行在片延伸反應(yīng)，使部分雙分子雙鏈寡核苷酸成為完整雙分子(completebimolecular)雙鏈寡核苷酸，形成NF-κB檢測dsDNA微陣列芯片(雙分子寡核苷酸通用引物點樣復(fù)性延伸法)；④固相化學(xué)合成兩條寡核苷酸，其中一條較長寡核苷酸上嵌合NF-κB結(jié)合位點，另一條較短的寡核苷酸作為通用引物，先將化學(xué)修飾的較長寡核苷酸與通用引物寡核苷酸在液相雜交復(fù)性成為部分雙分子(partialbimolecular)雙鏈寡核苷酸，將復(fù)性產(chǎn)物點樣連接固定到固相基質(zhì)表面，形成部分雙分子雙鏈寡核苷酸微陣列芯片，再用DNA聚合酶進行在片延伸反應(yīng)，使部分雙分子雙鏈寡核苷酸成為完整雙分子(completebimolecular)雙鏈寡核苷酸，形成NF-κB檢測dsDNA微陣列芯片(雙分子寡核苷酸通用引物復(fù)性點樣延伸法)；⑤固相化學(xué)合成兩條寡核苷酸，其中一條較長寡核苷酸上嵌合NF-κB結(jié)合位點，另一條較短的寡核苷酸作為通用引物，先將化學(xué)修飾的較長寡核苷酸與通用引物寡核苷酸在液相雜交復(fù)性成為部分雙分子(partialbimolecular)雙鏈寡核苷酸，再用DNA聚合酶進行延伸反應(yīng)，使部分雙分子雙鏈寡核苷酸成為完整雙分子(completebimolecular)雙鏈寡核苷酸，將延伸產(chǎn)物點樣連接固定到固相基質(zhì)表面，形成NF-κB檢測dsDNA微陣列芯片(雙分子寡核苷酸通用引物復(fù)性延伸點樣法)；⑥合成一條長寡核苷酸，使寡核苷酸含有兩段鏈內(nèi)反向互補序列，且反向互補序列內(nèi)含有NF-κB結(jié)合位點，將復(fù)性寡核苷酸點樣連接固定到固相基質(zhì)表面，形成寡核苷酸微陣列芯片，通過變性再復(fù)性成為單分子(unimolecular)雙鏈寡核苷酸微陣列芯片，形成NF-κB檢測dsDNA微陣列芯片；此法也可以先在液相進行變性再復(fù)性，然后點樣連接固定到固相基質(zhì)表面，形成寡核苷酸微陣列芯片(單分子鏈內(nèi)互補法)；⑦合成一條較短的寡核苷酸，使寡核苷酸含有NF-κB結(jié)合位點，并且在其3′端(羥基)含有兩段鏈內(nèi)反向互補 |
| 摘要 | 本發(fā)明在固相支持物(solid substrates)表面制備一種雙鏈脫氧核糖核酸(double-strandedDNA，dsDNA)微陣列(microarray)，使其dsDNA探針(probes)上嵌合核因子κB(nuclear factorκB，NF-κB)的序列特異性DNA結(jié)合位點(sequence-specific DNA-binding sites)，用以高通量檢測(high-throughput detecting)細胞核內(nèi)NF-κB的含量及篩選dsDNA/NF-κB相互作用干擾性分子(molecules interfering dsDNA/NF-κB interaction)。本發(fā)明首先依靠專利技術(shù)(中國專利02112780.8及02137945.9)及其它本發(fā)明提出的方法，在固相支持物表面制備dsDNA微陣列，使該dsDNA微陣列上的大量dsDNA探針上含有NF-κB的序列特異性DNA結(jié)合位點，再將該dsDNA微陣列與特定細胞核蛋白或NF-κB純蛋白雜交結(jié)合，通過NF-κ、B與微陣列靶點dsDNA的相互作用，實現(xiàn)對特定細胞核中NF-κB蛋白的定性或定量測定，或通過檢測在外源分子，如組合化學(xué)分子、天然生物分子的存在下，NF-κB與微陣列靶點dsDNA相互作用特征的改變，篩選能夠干擾NF-κB與其靶點dsDNA的相互作用的分子，特別是能夠降低NF-κB與其靶點dsDNA結(jié)合親合性(binding affinity)的組合化學(xué)或天然生物小分子。本發(fā)明制備的NF-κB檢測dsDNA微陣列芯片，在基礎(chǔ)分子生物學(xué)研究，特別是NF-κB相關(guān)基因表達調(diào)控和生物醫(yī)學(xué)研究，如NF-κB相關(guān)疾病藥物作用機理研究和藥物性分子篩選中有廣泛而重要的應(yīng)用價值。 |
| 國際公布 |
