一種高通量直接定向克隆構(gòu)建重組腺病毒的方法
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公開(公告)號
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CN1624145A
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公開(公告)日
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2005.06.08
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申請(專利)號
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CN200410060972.6
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申請日期
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2004.10.19
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專利名稱
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一種高通量直接定向克隆構(gòu)建重組腺病毒的方法
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主分類號
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C12N15/861
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分類號
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C12N15/861;C12N15/66
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分案原申請?zhí)? |
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優(yōu)先權(quán)
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申請(專利權(quán))人
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湖北大學(xué)
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發(fā)明(設(shè)計)人
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馬立新;張娟;陶然
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地址
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430062湖北省武漢市武昌區(qū)寶集安
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頒證日
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國際申請
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進入國家日期
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專利代理機構(gòu)
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武漢金堂專利事務(wù)所
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代理人
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丁齊旭
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國省代碼
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湖北;42
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主權(quán)項
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一種高通量直接定向克隆構(gòu)建重組腺病毒的方法，主要包括一個已有的腺病毒表達載體和經(jīng)PCR引物擴增的目的基因，其特征在于通過對已有的腺病毒載體系統(tǒng)進行成功的定點誘變和同源重組的修飾，在該載體中引入了兩個唯一的特殊限制性內(nèi)切酶酶切位點序列和一個抗性基因表達單元，在擴增目標基因的一對PCR引物的5’端分別引進3～5個特定的堿基，在dTTP、或者dATP、或者dGTP、或者dCTP存在條件下，擴增產(chǎn)物經(jīng)T4DNA聚合酶消化后產(chǎn)生的粘性末端與載體雙酶切得到的粘性末端匹配，從而可以定向克隆在經(jīng)ClaI、AscI雙酶切的載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，通過抗性篩選及PCR鑒定或功能鑒定得到重組質(zhì)粒，重組質(zhì)粒經(jīng)線性化后，可直接轉(zhuǎn)染腺病毒包裝細胞系，得到重組腺病毒粒子。
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摘要
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本發(fā)明提出了一種能夠直接定向與用T4DNA聚合酶消化經(jīng)特殊設(shè)計的引物擴增的PCR產(chǎn)物進行連接，然后通過抗性篩選，從而一步構(gòu)建得到重組腺病毒質(zhì)粒的方法。得到的重組腺病毒質(zhì)粒經(jīng)過限制性內(nèi)切酶PacI線性化，轉(zhuǎn)化哺乳動物包裝細胞系，就能夠得到成熟的重組腺病毒。利用本發(fā)明能夠高通量構(gòu)建重組腺病毒，以盡可能真實的表達哺乳動物cDNA，且構(gòu)建重組腺病毒的實驗周期短，成本低，特別適合大規(guī)模表達哺乳動物來源的cDNA。是一個非常有效的構(gòu)建重組腺病毒的方法。
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國際公布
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