| 公開(kāi)(公告)號(hào) | CN1693479A |
| 公開(kāi)(公告)日 | 2005.11.09 |
| 申請(qǐng)(專利)號(hào) | CN200510037780.8 |
| 申請(qǐng)日期 | 2005.02.01 |
| 專利名稱 | 細(xì)胞角蛋白19(CK19)mRNA熒光定量RT-PCR檢測(cè)試劑盒 |
| 主分類號(hào) | C12Q1/68 |
| 分類號(hào) | C12Q1/68;C12Q1/25 |
| 分案原申請(qǐng)?zhí)? | |
| 優(yōu)先權(quán) | |
| 申請(qǐng)(專利權(quán))人 | 合肥中科大生物技術(shù)有限公司 |
| 發(fā)明(設(shè)計(jì))人 | 田志剛;魏海明;程 民;朱聰杰 |
| 地址 | 230027安徽省合肥市金寨路96號(hào)科大西區(qū)生命科學(xué)學(xué)院 |
| 頒證日 | |
| 國(guó)際申請(qǐng) | |
| 進(jìn)入國(guó)家日期 | |
| 專利代理機(jī)構(gòu) | 合肥華信專利商標(biāo)事務(wù)所 |
| 代理人 | 余成俊 |
| 國(guó)省代碼 | 安徽;34 |
| 主權(quán)項(xiàng) | 細(xì)胞角蛋白19(CK19)mRNA熒光定量RT-PCR檢測(cè)試劑盒，其特征為：它包含細(xì)胞裂解液I、細(xì)胞裂解液II、RNA洗滌緩沖液I、RNA洗滌緩沖液II、無(wú)RNA酶的水、RNA分離柱、反轉(zhuǎn)錄緩沖液、dNTP混合物、逆轉(zhuǎn)錄酶儲(chǔ)存液、PCR反應(yīng)液、探針、標(biāo)準(zhǔn)品、對(duì)照品；以上各種溶液所用溶劑均為水；(1)、細(xì)胞裂解液I包含0.1mol/LTris-HCl(三羥甲基氨基甲烷-鹽酸，pH7.6，25℃)、0.1mol/L氯化鈉、0.05mol/L氯化鎂、水；(2)、細(xì)胞裂解液II包含3mol/L異硫氰酸胍、2mol/L鹽酸胍、0.3mol/L醋酸鈉(pH5.2)、0.2％(W/V)SDS(十二烷基硫酸鈉)、水；(3)、RNA洗滌緩沖液I包含0.2mol/L醋酸鈉(pH5.2)、0.1mol/L氯酸鈉、0.1mol/LTris-HCl(pH7.5，25℃)、水；(4)、RNA洗滌緩沖液II包含1.2mol/L檸檬酸鈉、0.5mol/LTris-HCl(pH7.5，25℃)、水；(5)、無(wú)RNA酶的水通過(guò)下列方法制得：向去離子水加入DEPC(焦碳酸二乙酯)，至終濃度為0.05％(V/V)，室溫(22-25℃)放置10-12小時(shí)后，121℃，20min高壓，室溫放置備用；(6)、RNA分離柱是一種硅膠柱，可以特異性結(jié)合RNA，并可用水洗脫RNA，達(dá)到分離純化RNA的目的；(7)、反轉(zhuǎn)錄緩沖液包含9.1μmol/LOligo(dT)12-18、3.6U/μlRnaseInhibitor、72.7mmol/LDTT(二硫蘇糖醇)、182mmol/LTris-HCl(pH8.3，25℃)、273mmol/LKCl、11mmol/LMgCl2、水；(8)、逆轉(zhuǎn)錄酶儲(chǔ)存液包含20mmol/LTris-HCl(pH7.5，25℃)、100mmol/LNaCl、0.1mmol/LEDTA、1.0mmol/LDTT、50％(V/V)甘油、0.01％(V/V)Nonidetp-40、200U/μl逆轉(zhuǎn)錄酶(M-MLV)、水；(9)、dNTP混合物包含dATP、dCTP、dGTP、dTTP，為其鈉鹽-水溶液，pH7.0-7.5，四種dNTP濃度均為10mmol/L；(10)、PCR反應(yīng)液包含18.5mmol/LTris-HCI(pH8.3，25℃)、2.78mmol/LMgCI2、92.6mmol/LKCI、上下游引物(0.37μmol/L)、0.1U/μlTaq酶、dNTP混合物(dATP，dCTP，dGTP，dTTP，其濃度均為400nmol/L)、水；上下游引物序列分別為：P1：5’-ACTACAGCCACTACTACACGAC-3’，P2：5’-CAGAGCCTGTTCCGTCTCAAAC-3’(11)、探針為熒光標(biāo)記探針，其序列為：5’-FAM-TCTGGCTGCAGATGACTTCCGAACCA-TAMRA-3’探針的濃度為：2μmol/L，TE(10mmol/LTris-HCl，1mmol/LEDTA，水)溶解；(12)、標(biāo)準(zhǔn)品的序列分別為：1CAGAGCCTGTTCCGTCTCAAACTTGGTTCGGAAGTCATCTGCAGCCAGAC51GGGCGTTGTCGATCTGCAGGACAATCCTGGAGTTCTCAATGGTGGCACCA101AGAATCTTGTCCCGCAGGTCCTGGATGGTCGTGTAGTAGTGGCTGTAGT其濃度為：106copies/μl，TE(10mmol/LTris-HCl，1mmol/LEDTA，水)溶解；(13)、對(duì)照品分為陽(yáng)性對(duì)照品與陰性對(duì)照品，陽(yáng)性對(duì)照品為有CK19cDNA的樣品(104copies/μl，TE溶解)，陰性對(duì)照品為外周血總RNA的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。 |
| 摘要 | 本發(fā)明涉及一種細(xì)胞角蛋白19(CK19)mRNA熒光定量RT-PCR檢測(cè)試劑盒，該試劑盒包含總RNA提取液(細(xì)胞裂解液I、細(xì)胞裂解液II、RNA洗滌緩沖液I、RNA洗滌緩沖液II和無(wú)RNA酶的水)，反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液，dNTP混合物，逆轉(zhuǎn)錄酶，PCR反應(yīng)液，探針，陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品，對(duì)照品。本發(fā)明通過(guò)對(duì)新鮮抗凝外周血提取總RNA，并通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄mRNA樣品得到cDNA，再結(jié)合實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)技術(shù)，可準(zhǔn)確定量檢測(cè)標(biāo)本中CK19的mRNA的表達(dá)量。本發(fā)明所提供的試劑盒可用于臨床及科研中檢測(cè)腫瘤患者的外周血、骨髓、淋巴結(jié)及癌組織中CK19 mRNA的表達(dá)，為各種乳腺癌、小細(xì)胞肺癌的早期診斷、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)、治療方案的確定及預(yù)后的判斷提供重要的參考依據(jù)。 |
| 國(guó)際公布 |
