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重組人甲狀旁腺激素在大腸桿菌中的構(gòu)建、表達(dá)與純化方法

公開(kāi)(公告)號(hào) CN1706947A  
公開(kāi)(公告)日 2005.12.14  
申請(qǐng)(專(zhuān)利)號(hào) CN200410055552.9  
申請(qǐng)日期 2004.08.04  
專(zhuān)利名稱(chēng) 重組人甲狀旁腺激素在大腸桿菌中的構(gòu)建、表達(dá)與純化方法  
主分類(lèi)號(hào) C12N15/16  
分類(lèi)號(hào) C12N15/16;C12N15/70;C07K14/635;A61K38/29  
分案原申請(qǐng)?zhí)?  
優(yōu)先權(quán) 2004.6.4 CN 200410044917.8  
申請(qǐng)(專(zhuān)利權(quán))人 南京大學(xué)生物制藥工程研究中心  
發(fā)明(設(shè)計(jì))人 劉建寧;孫自勇;張 菁;陳均勇;陳新園  
地址 210093江蘇省南京市漢口路22號(hào)南京大學(xué)蒙民偉樓22層  
頒證日  
國(guó)際申請(qǐng)  
進(jìn)入國(guó)家日期  
專(zhuān)利代理機(jī)構(gòu) 南京天華專(zhuān)利代理有限責(zé)任公司  
代理人 夏 平  
國(guó)省代碼 江蘇;32  
主權(quán)項(xiàng) 一種重組人甲狀旁腺激素在大腸桿菌中的構(gòu)建、表達(dá)與純化方法,其特征在于:a.重組人甲狀旁腺激素的構(gòu)建:以下述基因序列為模板,CCGCGGGTATTGAGGGTCGCTCCGTTTCTGAAATCCAGCTGATGCACAACCTGGGTAAACACCTGAACTCTATGGAACGTGTTGAATGGCTGCGTAAGAAACTGCAGGACGTACACAACTTCTAACTCGAG,實(shí)線處分別為SacII、XhoI的酶切位點(diǎn),虛線處序列編碼FactorXa識(shí)別位點(diǎn)Ile-Glu-Gly-Arg↓,以GGACTGCCGCGGGTATTGAGGGTCGCTCCGTTTC為上游引物序列,實(shí)線處為SacII的酶切位點(diǎn),通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)合成重組人甲狀旁腺激素基因;b.通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)合成的重組人甲狀旁腺激素基因經(jīng)SacII、XhoI雙酶切后與經(jīng)SacII、XhoI雙酶切的表達(dá)質(zhì)粒pET-35b(+)連接,將連接后的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coliDH5α宿主菌進(jìn)行重組人甲狀旁腺激素的表達(dá);c.表達(dá)的重組人甲狀旁腺激素以纖維素樹(shù)脂(CBIND200Resin)親和層析分離純化。  
摘要 本發(fā)明涉及醫(yī)藥生物工程技術(shù)領(lǐng)域,是包括涉及編碼人甲狀旁腺激素小肽的cDNA,和利用其表達(dá)載體制備人甲狀旁腺激素的方法。本發(fā)明將化學(xué)合成的重組人甲狀旁腺激素(1-34)基因用PCR擴(kuò)增后,克隆至表達(dá)載體pET-35b(+),使重組人甲狀旁腺激素(1-34)融合于纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域(CBDclos)的羧基端,并得到高效表達(dá)。融合蛋白經(jīng)纖維素樹(shù)脂親和層析純化后,經(jīng)Factor Xa裂解釋放出rhPTH(1-34),再通過(guò)纖維素樹(shù)脂親和層析、C4反向高效液相色譜純化得到rhPTH(1-34)純品。每升培養(yǎng)液可獲取3mg高純度的rhPTH(1-34)。經(jīng)質(zhì)譜測(cè)定,所得樣品的分子量為4117.0道爾頓,與rhPTH(1-34)理論分子量一致。本發(fā)明極大程度上豐富了該多肽在醫(yī)藥生物工程技術(shù)領(lǐng)域的研究和開(kāi)發(fā)。  
國(guó)際公布  
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