公開(公告)號(hào)
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CN1261566C
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公開(公告)日
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2006.06.28
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申請(qǐng)(專利)號(hào)
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CN200410005171.X
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申請(qǐng)日期
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2004.02.11
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專利名稱
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非受體型酪氨酸蛋白激酶Syk的制備方法
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主分類號(hào)
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C12N9/12(2006.01)I
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分類號(hào)
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C12N9/12(2006.01)I;C12N15/54(2006.01)I;C12N15/63(2006.01)I;C07K16/06(2006.01)I;C07K16/40(2006.01)I;A61K38/45(2006.01)I;C12Q1/68(2006.01)I;G01N33/53(2006.01)I
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分案原申請(qǐng)?zhí)? |
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優(yōu)先權(quán)
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申請(qǐng)(專利權(quán))人
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單保恩
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發(fā)明(設(shè)計(jì))人
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馬 洪;單保恩
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地址
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050011河北省石家莊市健康路12號(hào)河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院科研中心
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頒證日
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國際申請(qǐng)
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進(jìn)入國家日期
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專利代理機(jī)構(gòu)
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石家莊新世紀(jì)專利商標(biāo)事務(wù)所有限公司
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代理人
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董金國
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國省代碼
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河北;13
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主權(quán)項(xiàng)
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非受體型酪氨酸蛋白激酶Syk的制備方法,其特征在于它包括以下工藝步驟:A、細(xì)胞株及細(xì)胞培養(yǎng):Sf21細(xì)胞株應(yīng)用Grace′s培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng),將細(xì)胞調(diào)整到1×109/L的密度,用培養(yǎng)瓶于恒溫?fù)u床在轉(zhuǎn)速為80-100轉(zhuǎn)/分、溫度26-28℃條件下進(jìn)行培養(yǎng),經(jīng)胎盼藍(lán)染色檢測(cè)活細(xì)胞百分率應(yīng)為95%-100%;B、應(yīng)用Bac-to-Bac方法進(jìn)行制備重組Syk基因的桿狀病毒;C、純化baconidSykDNA:應(yīng)用脂質(zhì)體介導(dǎo)技術(shù),將轉(zhuǎn)染Syk基因的Sf21細(xì)胞于28℃培養(yǎng)4-6天,用Gibco-BRL公司提供的cellfectin試劑進(jìn)行選擇培養(yǎng),收集細(xì)胞制備SykDNA;應(yīng)用噬菌體純化法純化病毒顆粒,經(jīng)培養(yǎng)一些孔形成噬菌斑,將這些陽性培養(yǎng)孔細(xì)胞經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)Mr為72×103蛋白條帶的存在;D、Sf21細(xì)胞的大量制備:于培養(yǎng)瓶中加入1L呈對(duì)數(shù)生長期的Sf21細(xì)胞懸液,每毫升細(xì)胞懸液中的含Sf21細(xì)胞1.0-1.2×106個(gè),加入病毒貯存液,其病毒濃度約為2.5×108pfu/mL,于恒溫?fù)u床在80-100轉(zhuǎn)/分、溫度為28℃條件下培養(yǎng)48小時(shí)進(jìn)行病毒感染和細(xì)胞增殖,其病毒感染率約為6;E、Syk的分離、純化:收集細(xì)胞懸液進(jìn)行低速離心,將細(xì)胞數(shù)量為2.5×109的細(xì)胞沉淀物與細(xì)胞裂解液共同培養(yǎng)30分鐘,于冰浴中用超聲波破碎儀振蕩裂解3次,每次30秒,將細(xì)胞裂解液于4℃超速離心,收集上清液并過濾,將濾液加入由Sigma生產(chǎn)、規(guī)格為2.5×10cm的活化的Yellow-3層析柱,用兩倍體積的緩沖液和1倍體積的含有200mmol/LNaCl的緩沖液沖洗層析柱。Syk蛋白用3.5倍體積的含200mmol/L-1mol/LNaCl的緩沖液洗脫。
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摘要
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本發(fā)明屬于基因治療領(lǐng)域,特別是指一種輔助乳腺癌診斷、治療方案制定及估計(jì)預(yù)后的相關(guān)基因-非受體型酪氨酸蛋白激酶Syk的制備方法。主要包括細(xì)胞株及細(xì)胞培養(yǎng)、應(yīng)用Bac-to-Bac方法進(jìn)行制備重組Syk基因的桿狀病毒、純化baconid Syk DNA、Sf21細(xì)胞的大量制備、Syk的分離、純化等工藝步驟。本發(fā)明解決了乳腺癌的早期診斷、治療方案選擇、病情復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移監(jiān)測(cè)、療效評(píng)價(jià)和預(yù)后估價(jià)以及群體隨訪觀察和普查等方面的問題,具有工藝設(shè)計(jì)合理,可輔助乳腺癌診斷、治療方案制定及估計(jì)預(yù)后等優(yōu)點(diǎn)。
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國際公布
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