| 公開(公告)號 | CN1807638A |
| 公開(公告)日 | 2006.07.26 |
| 申請(專利)號 | CN200510062387.4 |
| 申請日期 | 2005.12.31 |
| 專利名稱 | 靶向抗肺癌SOD的構(gòu)建與表達的方法 |
| 主分類號 | C12N15/53(2006.01)I |
| 分類號 | C12N15/53(2006.01)I;C12N15/62(2006.01)I;C12N1/21(2006.01)I;C12N9/08(2006.01)I |
| 分案原申請?zhí)? | |
| 優(yōu)先權(quán) | |
| 申請(專利權(quán))人 | 浙江大學(xué) |
| 發(fā)明(設(shè)計)人 | 龔興國 |
| 地址 | 310027浙江省杭州市西湖區(qū)玉古路20號 |
| 頒證日 | |
| 國際申請 | |
| 進入國家日期 | |
| 專利代理機構(gòu) | 杭州中成專利事務(wù)所有限公司 |
| 代理人 | 唐銀益 |
| 國省代碼 | 浙江;33 |
| 主權(quán)項 | 一種抗肺癌SOD的構(gòu)建的方法，其特征在于依次包括以下步驟： (1)從含念珠藻CHENFe-SOD(NostoccommunestrainCHENFe-SOD)的pET-SOD質(zhì)粒中TD-PCR擴增獲得Fe-SOD基因； TD-PCR擴增所用引物： SOD-Nco：5’-CATGCCATGGCATTTGTACAGCTCCCACTACCCTTTG含NcoI位點， SOD-Sal：5’-GCGTCGACTCCGCCTCCACCAGCTTTGGCCAAGTTTTC含SalI位點， 引物SOD-Sal去除Fe-SOD基因序列3’端的TAA終止密碼子，并在其末端加上編碼GGGG的密碼子，即：GGCGGAGGCGGA； (2)以含ScFv的T-ScFv質(zhì)粒為模板TD-PCR擴增獲得ScFv基因； TD-PCR擴增所用引物： ScFv-Sal：5’-ACGCGTCGACGTCCAACTGCAGGAGTCAGG含SalI位點， ScFv-Not：5’-ATAAGAATGCGGCCGCCTATTTGATCTCGAGCTTGGTC含NotI位點； 引物ScFv-Not末端含TAG終止密碼子； (3)以NcoI，SalI酶切步驟(1)得到的Fe-SOD基因； (4)以SalI，NotI酶切步驟(2)得到的ScFv基因； (5)將步驟(3)和(4)得到的基因重組得到SOD-ScFv融合基因，并重組進經(jīng)NcoI，NotI酶切的pET28a(+)質(zhì)粒載體，控制此融合基因5’端與T7啟動子之間的距離，構(gòu)建得到Pet-SOD-ScFv融合載體； (6)將Pet-SOD-ScFv融合載體轉(zhuǎn)化至感受態(tài)大腸桿菌BL21，命名為Pet-SOD-ScFv工程菌。 |
| 摘要 | 本發(fā)明公開了一種pET-SOD工程菌的構(gòu)建及其表達純化方法，本發(fā)明通過下述技術(shù)方案予以實現(xiàn)：設(shè)計引物從含念珠藻CHEN Fe-SOD的pET-SOD質(zhì)粒中擴增獲得Fe-SOD基因；設(shè)計引物從含ScFv的T-ScFv質(zhì)粒擴增獲得ScFv基因；酶切Fe-SOD基因和ScFv基因后重組得到SOD-ScFv融合基因，并重組進pET28a(+)質(zhì)粒載體，構(gòu)建得到Pet-SOD-ScFv融合載體，轉(zhuǎn)化至感受態(tài)大腸桿菌BL21，得到Pet-SOD-ScFv工程菌；加入IPTG和Fe3+誘導(dǎo)，SOD-ScFv獲得表達。利用本發(fā)明，SOD-ScFv獲得高效表達，提高了SOD對腫瘤細胞的識別、定位和透膜能力。 |
| 國際公布 |
