| 公開(公告)號 | CN1840707A |
| 公開(公告)日 | 2006.10.04 |
| 申請(專利)號 | CN200610013091.8 |
| 申請日期 | 2006.01.23 |
| 專利名稱 | 基于免疫耐受樹突細胞篩選免疫耐受相關疾病的基因RGS1的方法 |
| 主分類號 | C12Q1/68(2006.01)I |
| 分類號 | C12Q1/68(2006.01)I;C12Q1/04(2006.01)I;C12N5/08(2006.01)I |
| 分案原申請?zhí)? | |
| 優(yōu)先權 | |
| 申請(專利權)人 | 南開大學 |
| 發(fā)明(設計)人 | 楊榮存;劉 昱;R.盧登;W.如適;張 園;張灼寒 |
| 地址 | 300071天津市衛(wèi)津路94號南開大學醫(yī)學院 |
| 頒證日 | |
| 國際申請 | |
| 進入國家日期 | |
| 專利代理機構 | 天津市學苑有限責任專利代理事務所 |
| 代理人 | 趙尊生 |
| 國省代碼 | 天津;12 |
| 主權項 | 一種基于免疫耐受樹突細胞篩選免疫耐受相關疾病的基因RGS1的方法，，其特征在于包括下述步驟： (1)免疫耐受樹突細胞的制備和鑒定 1)取4-6周小鼠的骨髓細胞，用水溶解去除紅細胞后，在1000單位GM-CSF，10％FCSRPMI1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，37℃下培養(yǎng)4天的骨髓起源的樹突細胞作為未成熟的樹突細胞； 2)未成熟的樹突細胞用生理鹽水洗三次，分別與鼠卵巢癌腫瘤細胞，已照射卵巢癌細胞或卵巢癌細胞上清液共同培養(yǎng)9天； 3)用2μlFITC螢光素標記的CD80抗體染鼠卵巢腫瘤細胞與樹突細胞，鼠卵巢腫瘤細胞與樹突細胞混和培養(yǎng)在10％FCSRPMI1640培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)9天，用流式細胞儀分離樹突細胞，得免疫耐受樹突細胞； 4)首先對免疫耐受樹突細胞的形態(tài)結構進行了觀察，觀察腫瘤相關免疫耐受樹突細胞的形態(tài)與結構； 5)腫瘤相關免疫耐受樹突細胞用生理鹽水洗三次后，分別加2μlFITC螢光素標記的抗CD40、CD80和CD86抗體染色，流式細胞儀分析，分析免疫耐受樹突細胞刺激分子的表達； 6)用類乳頭瘤病毒質粒(VLP)免疫鼠引導的特異性T細胞作為靶細胞，腫瘤相關免疫耐受樹突細胞與對照樹突細胞在裝載類乳頭瘤病毒質粒(VLP)后作為刺激細胞；共同培養(yǎng)48小時，取上清液，通過酶聯(lián)免疫檢測試劑盒分析上清液中的IFN-γ含量； (2)免疫耐受樹突細胞內免疫耐受基因的篩選 1)用Trizol試劑從腫瘤相關性樹突細胞提取總RNA； 2)對腫瘤相關性樹突細胞總RNA通過基因芯片進行分析，所用基因芯片是AffymetrixMouseU74GeneChipseries(U74A，U74B和U74C)，由美國約翰霍普金斯大學醫(yī)學院基因組研究室分析： 1、用寡核苷酸和dT作為引物以及SuperScriptchoice合成單股cDNA； 2、然后合成雙股cDNA，雙股cDNA通過苯酚-氯仿(1∶1體積)抽提后，利用BioArrayRNAhighyieldTranscriptlabeling試劑盒，通過體外轉錄產生Biomylatedanti-sensecRNA； 3、處理過的cRNA在45℃下與Affymetrix基因組基因芯片雜交，用AffymetrixFluidicsStation400洗染基因芯片除去未雜交的cRNA，然后用streptavidin-PE結合BiotimylatedcRNA，再與羊抗-streptavidinAb孵育；用Hewlett-PackardG2500GeneArray檢測熒光強度，用MicroArraySuite5.0軟件對每個基因芯片進行圖像分析； 4、采用AgilentBioanalyzer(PaloAlto，CA)與“Labonachip”(芯片實驗室)進行證實所有樣本有著類似的rRNA比率， 5、根據(jù)美國基因庫提供生物信息，對在腫瘤相關免疫耐受樹突細胞基因芯片分析中明顯上調的基因或明顯下調的基因結合基因庫提供生物信息進行分析； 6、RGS1基因在腫瘤相關的樹突細胞的高水平表達通過半定量PCR和定量PCR進一步評價，根據(jù)基因庫提供生物信息，找出在腫瘤相關免疫耐受樹突細胞中明顯上調的RGS1基因序列；序列： 5’atgccaggaatgttcttttctgctagcccaaaggattcgaaagaacacagccattctctt ctagacgacaaaaagcagaaaaaaaggccaaagacttttggaatggacgtgaaaacatac ctgagatcgatgatcccacatctggaatctgggatgaaatcggccaagtccaaagacata ctttctgctgaagaagtaatgcagtggtctcagtctctggaaaaactccttgccaaccag acaggtcaaaatgtctttggaagatttctaaagtctgaattcagtgaggaaaatattgaa ttctggttggcttgtgaggactataagaaaacagagactgatcttttgcataacaaagca gagaatatatacaaagcatttgtgcattcagatgctgtgaaacaaatcaatattgacttc catactcgagaatcgacagccaagaagattaaaacaccaactcccacatcttttgatgaa gcacaaaaagtcatatattcactcatggaaaaagattcttatcccaggttcctgaaatca aatatttacttaaatcttctaaatgaccttcaggcaaatactttaaagtga3’ 設計RGS1基因引物：5’atgccaggaatgttcttttctgctag-3’和3’ctttaaagtatttgcctgaaggtc-5’，用Invitrogen提供的RT-PCR試劑盒進行分析，用SybrGreenI檢測模式通過定量PCR，用TAKARA公司提供的SYBRgreenI螢光染料測定RGS1的轉錄水平； (3)克隆RGS1基因 從腫瘤相關性樹突細胞用Trizol試劑提取總RNA，用RGS1引物：5’atgccaggaatgttcttttctgctag-3’和3’ctttaaagtatttgcctgaaggtc-5’，通過Invitrogen公司提供的RT-PCR試劑盒，按照該公司提供的實驗步驟擴增RGS1基因，通過Invitrogen膠提取試劑盒提取擴增的RGS1基因片段，然后通過Invitrogen公司提供的pCDNA3.1His/V5ToPo載體，根據(jù)該公司提供的實驗步驟將RGS1基因克隆到pCDNA3.1His/V5ToPo載體，最后，通過測序確定上述列出的RGS1序列； (4)對篩選的腫瘤相關免疫耐受相關基因功能進一步鑒定： 1)用載有免疫耐受基因RGS1載體與pNF-KappaB-Seap報告基因通過lipofectin2000(Invitrogen)共同轉染RAW264.7細胞，然后用1μg/mlLPS或25μg/mlPolyI:C刺激，24小時后吸取上清液，上清液用，GreatEscApeSEAPChernilumineScence檢測試劑盒分析上清液的化學發(fā)光強度； 2)腫瘤相關免疫耐受基因RGS1轉染的RAW264.7，在600μg/mlG418選擇條件下，建立穩(wěn)定轉染的細胞系，染色后通過流式細胞儀分析這些穩(wěn)定轉染的細胞表面刺激分子CD40、CD80和CD86及其它共刺激分子的表達；同時，分析這 |
| 摘要 | 本發(fā)明提供了基于免疫耐受樹突細胞篩選免疫耐受相關疾病基因RGS1的方法。通過體外培養(yǎng)建立了制備人免疫耐受樹突細胞，RGS1基因在免疫耐受樹突細胞中的表達明顯升高。當RGS1基因或靶向這些基因的siRNA轉染單核細胞系，影響轉錄因素的激活，細胞因子的產生和共刺激分子的表達；重要的是轉染免疫調節(jié)細胞樹突細胞后能夠發(fā)揮特有的免疫調節(jié)功能，引導免疫耐受。這些基因在免疫相關性疾病如抗移植排斥反應、腫瘤、炎癥、自身免疫性疾病的治療方面有著巨大的潛在應用價值。 |
| 國際公布 |
