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1 材料與方法
1.1 藥物、試劑及儀器 布瑞寧(注射用葛根素，北京四環(huán)科寶制藥有限公司，0.1g/支，批號H20010776)。CK、NO檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所，ET檢測試劑盒購自天津九鼎醫(yī)學生物工程公司。動物呼吸機(成都泰盟科技公司)，BL420E生物機能實驗系統(tǒng)(成都泰盟科技公司)，紫外可見分光光度計(上海第三分析儀器廠)。
1.2 心肌I/R大鼠模型 阻斷LAD 血流造成缺血45 min，然后再灌注120 min[5,6]制作大鼠動物模型，以心電圖出現(xiàn)QRS波群高大增寬為結扎成功標志，以QRS波群振幅逐漸回落為再灌注成功標志。
1.3 實驗分組 Wistar大鼠24只，雌雄不拘，體重200～250 g，隨機分為4組，每組6只。(1)sham組：在LAD下穿線但不結扎，給予等量生理鹽水尾靜脈注射;(2)I/R組：缺血45 min，再灌注120 min，等量生理鹽水尾靜脈注射;(3)PUEA組：缺血前5 min尾靜脈緩慢推注PUE(100 mg/kg體重)，隨即進行I/R處理;(4)PUEB組：再灌注前5 min尾靜脈緩慢推注PUE(100 mg/kg體重)，隨即進行I/R處理。
1.4 血清CK活力、NO含量血漿和ET濃度 再灌注結束后，股動脈取血1.5 ml，4 ℃3 600 r/min離心15 min分離血清，嚴格按照試劑盒說明書檢測血清CK活力。血清NO含量測定：按上述方法分離得到血清后，按試劑盒說明書檢測血清NO含量。再灌注結束后股動脈取血2 ml，注入含7.5%EDTA·Na2 30 μl和抑肽酶40 μl的試管內(nèi)混勻，4 ℃ 3 600 r/min離心15 min，分離血漿，送內(nèi)分泌實驗室測定血漿ET濃度。
1.5 心肌梗死面積測定 再灌注結束后迅速取出心臟，原位結扎LAD，經(jīng)主動脈逆行灌注Evan藍1～2 ml，分離非缺血區(qū)和缺血區(qū)，用濾紙吸干后稱重，再將缺血區(qū)沿垂直于心臟縱軸方向切開，每片厚1～2 mm，置于1%TTC磷酸緩沖液(pH 7.4) 37 ℃孵育20 min，隨后分離壞死區(qū)(灰白色)和非壞死區(qū)(磚紅色)，濾紙吸干后分別稱重。梗死面積以壞死心肌重量與缺血區(qū)心肌重量之比表示，缺血面積以缺血區(qū)重量與全心重量之比表示。
1.6 數(shù)據(jù)分析 所有數(shù)據(jù)以(x±s)表示，用SPSS 10.0統(tǒng)計軟件包進行分析，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，P<0.05為差異有顯著性醫(yī).學.全.在.線zxtf.net.cn。
2 結果
2.1 心肌梗死面積 除sham組外，各組間缺血面積無明顯差異(P>0.05)。sham組未發(fā)生心肌梗死，I/R組左室心肌梗死面積達最多，PUEA、B組心肌梗死面積較I/R組明顯減小，表明缺血前和再灌注前給予葛根素均可以顯著縮小缺血再灌注引起的心肌梗死范圍，且二者效應相似。見表1。表1 各組心肌缺血面積和梗死面積
2.2 血清CK活力變化 I/R組CK活力較sham組明顯升高(P<0.05)，PUEA、B兩組CK活力較I/R組均明顯降低(P<0.05)，而且PUEA、B兩組間比較亦無顯著差異(P>0.05)。因此，缺血前和再灌注前給予葛根素預處理均可降低心肌缺血再灌注損傷時血清CK活力。結果見表2。表2 各組血清CK活力變化
2.3 血漿ET濃度、血清NO及比值變化 與sham組相比，I/R組ET濃度升高，NO濃度明顯降低，ET/NO比值升高顯著(P<0.05)。與I/R組相比，PUEA、B兩組較I/R組ET濃度降低，NO濃度升高，ET/NO比值明顯降低(P<0.05)，兩組與sham組各值比較差異無顯著性(P>0.05);PUEA、B兩組間亦差異不顯著(P>0.05)，見表3。表3 各組血漿ET及血清NO濃度變化注：(1)與sham組比較，P<0.05;(2)與I/R組比較，P<0.05。
3 討論
心肌缺血-再灌注損傷的機制復雜，目前認為與能量代謝障礙、自由基的作用、細胞內(nèi)鈣超負荷、無復流現(xiàn)象及白細胞的作用等有密切關系。現(xiàn)已公認，預處理，比如IPC、PPC、低氧預處理(hypoxic preconditioning，HPC)可對缺血-再灌注造成的組織器官損傷產(chǎn)生明顯的保護作用，因此，利用藥物代替IPC誘導再灌注損傷保護作用有潛在的臨床應用價值。
葛根為豆科屬植物，含異黃酮成分葛根素及葛根素木糖甙等，其藥理作用與黃酮相似，對心血管系統(tǒng)具有廣泛的藥理作用。葛根素可以使冠脈擴張，減少血小板聚集，改善微循環(huán);具有β受體阻滯作用以及鈣離子拮抗劑的電生理樣作用，減慢心率，使心肌耗氧量下降;調(diào)節(jié)血漿NO/ET比值，改善血管內(nèi)皮細胞功能;抗氧化、清除自由基作用，從而保護缺血心肌的功能[7]。本實驗采用結扎LAD的方法復制大鼠心肌缺血-再灌注損傷模型，通過觀察血清CK活力、血漿ET濃度、NO濃度及心肌梗死面積等指標，比較缺血前和再灌注前給予葛根素治療的缺血-再灌注損傷的保護效應是否有差異。實驗結果顯示，與sham組比較，大鼠心肌經(jīng)過45 min缺血和120 min再灌注后發(fā)生了明顯的損傷，表現(xiàn)在血清CK活力增高及明顯心肌梗死區(qū)域。心肌缺血-再灌注后血漿ET濃度明顯增加，這與文獻報道一致[8]，與此同時血清NO濃度降低、ET/NO比值增大，表明心肌細胞嚴重受損，同時還存在冠狀動脈內(nèi)皮細胞的明顯損傷，因為ET和NO是血管內(nèi)皮細胞分泌的血管活性物質(zhì)，ET收縮血管，NO松弛血管平滑肌，兩者正常情況下保持動態(tài)平衡，其水平可以反映血管內(nèi)皮功能狀態(tài)。大多數(shù)文獻資料以及以往的研究都已表明，在缺血前給予葛根素預處理能對心肌的缺血-再灌注損傷發(fā)揮明顯的保護作用。本實驗結果表明，葛根素缺血前給藥能使ET濃度降低、NO濃度升高，從而ET/NO保持平衡，葛根素可通過改善血管內(nèi)皮細胞，發(fā)揮明顯的抗心肌缺血-再灌注損傷保護作用。此外，本實驗結果還表明，再灌注前給予葛根素治療同樣可以產(chǎn)生效應相似的心臟保護作用，表明不同時機葛根素治療均可以產(chǎn)生保護效應，即都能產(chǎn)生PPC效應。有報道認為，再灌注前給予葛根素能明顯減少再灌注引起的細胞凋亡，而缺血前給藥抑制細胞凋亡的效果并不明顯[9]。推測這些結果的差異可能與葛根素缺血前抑或再灌前給藥發(fā)揮心肌保護作用的機制有所差異有關，此外也可能和實驗過程中所使用的研究方法和研究材料差異有關。
