護理論文小議抗ErbB2嵌合抗體chA21聚集現(xiàn)象
1 引言
目前在抗腫瘤的藥物治療方案中,基因工程抗體以其高特異性和低副作用的特點越來越受到重視。但是作為大分子蛋白的抗體在生產(chǎn)和保存過程中經(jīng)常有聚集現(xiàn)象的發(fā)生,不同抗體聚集情況有所差別。研究表明,抗體聚集的性質(zhì)有可逆的和不可逆的,聚集部位可位于可變區(qū)或恒定區(qū),聚集的程度與抗體本身特性和所處溶液條件密切相關。聚集可能會對抗體的活性和穩(wěn)定性有所影響,甚至使免疫原性增高,目前已成為抗體藥物開發(fā)的一大挑戰(zhàn)。本實驗室研制的嵌合抗體hA21 是將抗腫瘤相關抗原ErbB2 的單鏈抗體(sFv)與人抗體F 段融合而成(sFv-F),并在HO 細胞中成功以雙價形式表達。實驗表明,hA21 具有抑制高表達ErbB2 的乳腺癌和卵巢癌細胞生長的作用,目前已建立了適應大規(guī)模生產(chǎn)與純化的工藝體系,具有潛在的臨床應用前景。本文采取液相色譜等方法對hA21 出現(xiàn)的聚集現(xiàn)象進行了分析,并結(jié)合抗體本身結(jié)構特點對引起聚集的部位和原因進行了初步探索。
2 材料與方法
2.1 材料
2.1.1 嵌合抗體hA21
表達hA21 的HO 細胞為本實驗室構建,將細胞表達上清收集并經(jīng)過ProteinA 親和層析和SP 離子交換層析兩步純化后保存在0.02 mol/L(pH 5.5,含0.2 mol/L Nal)的醋酸鈉緩沖液中,經(jīng)SDS-PAGE 測定純度可達95%以上。
2.1.2 儀器
高壓液相分析系統(tǒng)為Agilent 公司產(chǎn)品, S300 分子篩層析柱為Phenomenex 公司產(chǎn)品, 動態(tài)光散射儀為DynaPro 公司產(chǎn)品, 圓二色譜儀為Jaso 公司產(chǎn)品, Protein A 親和柱以及Superdex G75 10/30 純化柱為Amersham 公司產(chǎn)品。
2.1.3 主要試劑蛋
白分子量標準購自Promega 公司,高表達ErbB2 的T6-17 細胞裂解液和不表達ErbB2的3T3 細胞裂解液為本實驗室保留,96 孔酶標板購自Nun 公司醫(yī).學.全.在.線zxtf.net.cn,HRP 標記的羊抗人多抗和木瓜蛋白酶購自Piere 公司,顯色底物OPD 購自AMRESO 公司,甘露醇(200 mg/mL)注射液購自豐原藥業(yè),所有化學試劑均為國產(chǎn)分析純。2.2 方法
2.2.1 高效排阻色譜(HPSE)鑒定hA21 聚集現(xiàn)象將兩步純化后的抗體濃度調(diào)整至1 mg/mL,并用0.45 μm 的濾膜過濾,取30 μL 樣品用HPSE S300 進行分析。流動相為0.05 mol/L 的pH 7.0 的磷酸鈉緩沖液,含0.3 mol/L的Nal,監(jiān)測波長為280 nm,流速為0.5 mL/min。
2.2.2 動態(tài)光散射(DLS)鑒定hA21 聚集現(xiàn)象
將兩步純化后的抗體濃度調(diào)整至3 mg/mL 并用0.45 μm 的濾膜過濾,取12 μL 加入樣品池。儀器溫度設為20,激光波長約824 nm,照射角度為90?,樣品加入穩(wěn)定20 min后開始測量,測定結(jié)果取20 個有效數(shù)據(jù)進行分析。