藥物分析-授課教案:第九章　維生素類藥物分析

基本內(nèi)容

注解（進展、輔助

手段和時間分配)

第九章　維生素類藥物的分析

維生素：是維持人體正常代謝機能所必需的一類活性物質(zhì)，主要用于機體的能量轉(zhuǎn)移和代謝調(diào)節(jié)。

人體不能合成維生素，須從食物中攝取。

中國藥典收載有30余個品種，按溶解度分為

脂溶性維生素：VitA、D₂、D₃、 E、K1 等 

水溶性維生素：VitB族(B₁、B₂、B₆、B₁₂)

  　　　　　　VitC、葉酸（VitM)、煙酸、煙酰胺（Vitpp)

　　　　　　　　　第一節(jié)　　維生素A的分析

維生素A(vitamin A)包括維生素A₁(視黃醇，retinol)、去氫維生素A（dehydroretionl，維生素A₂)和去水維生素A（anhydroretinol，維生素A₃)等，其中維生素A₁活性最高，維生素A₂的生物活性是維生素A₁的30%～40%，維生素A₃的生物活性是維生素A₁的0.4%。通常所說的維生素A系指維生素A₁，其為一種不飽和脂肪醇，在自然界中主要來自鮫類無毒海魚肝臟中提取的脂肪油（通稱為魚肝油)，其含量高達600000國際單位/克（IU/g)，多以各種酯類混合物的形式存在，其中主要為醋酸酯和棕櫚酯。目前主要采用人工合成方法提取。

中國藥典收載的維生素A是指人工合成的維生素A₁醋酸酯結(jié)晶加精制植物油制成的油溶液，還收載維生素A膠丸、維生素AD膠丸和維生素AD滴丸等。

美國藥典收載的維生素A是指維生素A及其醋酸酯、棕櫚酸酯混合物的食用油溶液。

英國藥典收載的人工合成濃縮維生素A是維生素A醋酸酯、丙酸酯和棕櫚酸酯混合物的植物油提取溶液。

R :　-H  維生素A醇

-COCH3  維生素A醋酸酯

   -COC15H31  維生素A棕櫚酸酯

講授結(jié)合多媒體教學(xué)

復(fù)習(xí)舊課（3min)

作業(yè)解析(5min)

引入新課(2min)

簡介

基本內(nèi)容

注解（進展、輔助

手段和時間分配)

（一)為一個具有共軛多烯側(cè)鏈的環(huán)己烯

1.具有UV吸收

2.存在多種立體異構(gòu)化合物

  相對生物效價　　　順反異構(gòu)

維生素A   325.5   100% 　　 　　全反

新維生素Aa   328  75%　　　　　2-順

新維生素Ab   320.5   24%　　　　   4-順

新執(zhí)業(yè)藥師維生素Ac   310.5 15%　　　　　2,4-二順

異維生素Aa   323  21%　　　  　6-順

異維生素Ab   324     24%　　　 　2,6-二順

3. 易發(fā)生脫氫、脫水、聚合反應(yīng)

Vit A₂

Vit A₃

鯨醇

5min，重點講解其全反式結(jié)構(gòu)及其不穩(wěn)定性。

基本內(nèi)容

注解（進展、輔助

手段和時間分配)

△或有金屬離子存在時氧化↑

環(huán)氧化物

VitA醛

VitA酸

（三)與三氯化銻發(fā)生呈色反應(yīng)

（四)溶解性

不溶于水

易溶于有機溶劑和植物油等

基本內(nèi)容

注解（進展、輔助

手段和時間分配)

（一)三氯化銻反應(yīng)

   條件：無水乙醇

藍色

   紫紅

（二)UV法（BP（1998))

λmax為326nm　　　　 λmax為350～390nm

一個吸收峰 三個吸收峰

5min，三氯化銻指出其存在不足：專屬性差，呈色不穩(wěn)定。

重點講解UV法。

基本內(nèi)容

注解（進展、輔助

手段和時間分配)

去水VitA（VitA3)

基本內(nèi)容

注解（進展、輔助

手段和時間分配)

BP   雜質(zhì)對照品法 

   　　　　　　　　顯色劑  三氯化銻

USP 顯色劑 磷鉬酸

    規(guī)定斑點顏色和R_f值

三、含量測定

（一)UV法

維生素A中常含有雜質(zhì)：立體異構(gòu)體、氧化產(chǎn)物及光照產(chǎn)物、合成中間體、去氫維生素A（ VitA₂)、去水維生素A（ VitA₃)。

三點校正法

1.  條件：

（1)雜質(zhì)的吸收在310~340nm波長范圍內(nèi)呈一條直線，且隨波長的增大吸收度減�。�

（2)物質(zhì)對光的吸收具有加和性。

2.  波長的選擇：

（1) l1

VitA的lmax（328nm)

（2) l2   l3

  分別在l1的兩側(cè)各選一點

第一法  等波長差法

測定對象  VitA醋酸酯

30min，此為本節(jié)、本章重點、難點，配合多媒體課件講解。

基本內(nèi)容

注解（進展、輔助

手段和時間分配)

測定對象  VitA醇

3. 測定法

（1)基本步驟:

v   第一步   A選擇

選擇依據(jù)：

所選A值中雜質(zhì)的干擾已基本消除

第二步  求

注意：

Ø   

C 為混合樣品的濃度 

基本內(nèi)容

注解（進展、輔助

手段和時間分配)

換算因數(shù)由純品計算而得：

第四步：求標(biāo)示量％

基本內(nèi)容

注解（進展、輔助

手段和時間分配)

　　　　方法：

判斷  是否在326～329nm之間

在326～329nm之間

　   　　　　　是　　　　　否　　　　　　　

　　　　　　　　求算　　　　　　　　改用第二法

   并與規(guī)定值比較

　　　規(guī)定值　　　差值 

基本內(nèi)容

注解（進展、輔助

手段和時間分配)

　　　有一個以上超過±0.02   無超過±0.02 

計算 A328（校正)   用A328計算

第二法　　　  　  　　　　第二法

　　　�。�15%　　　　－3%　　　　　　0　　　　3%

VitAD膠丸中VitA的含量測定

精密稱取本品(規(guī)格10000VitAIU/丸)裝量差異項下（平均裝量0.08262g/丸)的內(nèi)容物 0.2399g 至250ml量瓶中，用環(huán)己烷稀釋至刻度，搖勻；精密量取2.0ml，置另一20 ml量瓶中，用環(huán)己烷稀釋至刻度，搖勻。以環(huán)己烷為空白，測定最大吸收波長為328nm，并在下列波長處測得吸收度為

A300： 0.354   A300 /A328  ：0.555

A316： 0.561  A316/A328   ：0.907

A328： 0.628　　  　A328/A328   ：1.000

A340： 0.523 　　   A340/A328   ：0.811

A360： 0.216     A360/A328   ：0.299

求本品中維生素A的含量？

A300 /A328 ： 0.564－0.555＝+0.01

A316/A328 ：  0.893－0.907＝-0.01

A328/A328 ：  1.000－1.000＝0

A340/A328 ：  0.833－0.811＝+0.02

A360/A328 ：  0.344－0.299＝+0.04

基本內(nèi)容

注解（進展、輔助

手段和時間分配)

（3)第二法  （等吸收度法)

　　　　　　　[ 皂化法、6/7A法 ]

適用于維生素A醇

第一法無法消除雜質(zhì)干擾時用此法

基本內(nèi)容

注解（進展、輔助

手段和時間分配)

　　　　　　　　　　　　　　是　　　　　　　否

計算　　　　取未皂化樣品采用

色譜法純化后再測定

判斷是否大于0.73

　   　　　　　是　　　　　否　　　　　　　

　　　　　　　　求算（校正)　　 未皂化樣品采用色譜法

純化后再測定

　　　  －3%　　　　　　0　　　　　　3%

三氯化銻比色法  標(biāo)準(zhǔn)曲線法

　　　　　　　　　　　　　　λmax 618nm～620nm

優(yōu)點   簡便 快速

　　　　　　　　呈色不穩(wěn)定 （5 ~ 10s內(nèi))

　　　　　　　　水分干擾　　　

　缺點  與標(biāo)準(zhǔn)曲線溫差≤1℃

　　　　　　　　專屬性差

三氯化銻有腐蝕性

基本內(nèi)容

注解（進展、輔助

手段和時間分配)

課間休息十分鐘

   HCl

　　　　　　　　　CI^－

氨基嘧啶環(huán)－CH₂－噻唑環(huán)(季銨堿)

一、結(jié)構(gòu)與性質(zhì)

（一)溶解性

   1、易溶于水

　 2、水溶液呈酸性

（二)UV　共軛雙鍵

λmax = 246nm

（三)硫色素反應(yīng)

（四)堿性 嘧啶環(huán) —— 伯氨

　　　　　　　噻唑環(huán) —— 季銨

   1、可與酸成鹽

2、與生物堿↓→↓

3、含量測定 —— 非水堿量法

二、鑒別試驗

（一)硫色素反應(yīng)　　Ch.P

5min，其中：

結(jié)構(gòu)講解3min，重點為結(jié)構(gòu)中的伯胺、季胺鹽。

性質(zhì)講解2min.

5min

基本內(nèi)容

注解（進展、輔助

手段和時間分配)

（二)沉淀反應(yīng)　　VitB₁

（三)其他反應(yīng)

　　　　　　　　�。�硫元素反應(yīng))

　　　　　　　（CI^－反應(yīng))

基本內(nèi)容

注解（進展、輔助

手段和時間分配)

（一)非水溶液滴定法

   喹那啶紅－亞甲藍

（紫紅→天藍)

(二)UV法

15min，其中非水溶液滴定法和UV法講解15min，硫色素法講解5min。

計算板書講解

基本內(nèi)容

注解（進展、輔助

手段和時間分配)

   A=ELC

（每片)相當(dāng)于標(biāo)示量的%=

（每ml)相當(dāng)于標(biāo)示量的%=

（三)硫色素?zé)晒夥?/b>

計算板書講解。

基本內(nèi)容

注解（進展、輔助

手段和時間分配)

激發(fā)波長365nm

　　 發(fā)射波長435nm

   　　  + NaOH + 鐵氰化鉀 + 異丁醇　　　　　  　S

　　　對照液

  　　+ NaOH + 異丁醇　　　　　　　　　　 　　d

　　 + NaOH + 鐵氰化鉀 + 異丁醇　　　　　　　A

　　　供試液

   + NaOH + 異丁醇　　　　　　　　　　 　　b

3、特點

（1)靈敏度高，線性范圍寬

（2)代謝產(chǎn)物不干擾，適用于體液分析

第三節(jié) 維生素C

L－抗壞血酸

一、結(jié)構(gòu)與性質(zhì)

（一)溶解性

　  　1、易溶于水

2、水溶液呈酸性

   （二)強還原性 二烯醇結(jié)構(gòu)

15min,使用多媒體教學(xué)課件講解

基本內(nèi)容

注解（進展、輔助

手段和時間分配)

有活性 有活性 　　   無活性

(三) 具糖的性質(zhì)  結(jié)構(gòu)與糖類相似

糖類的顯色反應(yīng)

基本內(nèi)容

注解（進展、輔助

手段和時間分配)

C3－OH的 

pKa = 4.17

C2－OH的

pKa = 11.57

（六)水解反應(yīng)  與堿反應(yīng)

（七) UV特征

基本內(nèi)容

注解（進展、輔助

手段和時間分配)

（一)與氧化劑的反應(yīng)

1、與AgNO3反應(yīng)  (ChP2005)

2、與2，6 - 二氯靛酚反應(yīng)  (ChP2005)

基本內(nèi)容

注解（進展、輔助

手段和時間分配)

4、與KMnO4反應(yīng)

（二)糖類的反應(yīng)  USP

（三)UV  BP

0.01mol/L HCl

使用多媒體教學(xué)課件講解

問題討論(5min)

作業(yè)和習(xí)題布置(2min)

歸納總結(jié)(3min)

小 結(jié)

本次課主要講授了維生素A的含量測定方法----三點校正法(要求同學(xué)掌握)；維生素B₁所特有的專屬性鑒別反應(yīng)----硫色素反應(yīng)(要求同學(xué)熟悉)；維生素A、B、C的結(jié)構(gòu)與性質(zhì)(要求同學(xué)加以了解)。

復(fù)習(xí)思考題

或

作 業(yè) 題

1、維生素A不穩(wěn)定的原因及其不穩(wěn)定的因素？

2、三氯化銻用于維生素A鑒別的原理及其所存在的不足。

3、分析維生素A及去水維生素A的紫外吸收光譜。

4、維生素A紫外分光光度法（三點校正法)測定的原理是什么？

5、維生素B1的結(jié)構(gòu)、性質(zhì)及維生素B₁特有的反應(yīng)是什么？

6、為什么要對維生素C進行鐵和銅離子的檢查

教 學(xué) 效 果

與 分 析

多媒體教學(xué)和板書相結(jié)合，并結(jié)合一定的實例，加深學(xué)生對知識點的認識和了解。特別是通過問題討論，讓大家對所學(xué)知識進行回顧、討論，建立一個互動的教學(xué)氛圍，使同學(xué)們掌握本次課的學(xué)習(xí)內(nèi)容。效果較好。

基本內(nèi)容

注解（進展、輔助

手段和時間分配)

第三節(jié) 維生素C的分析

 三、含量測定

（一)碘量法

1、原理

指示劑 淀粉指示液

2、方法

取本品約0.2g，精密稱定，加新沸過的冷水100ml與稀醋酸10ml使溶解，加淀粉指示液1ml，立即用碘滴定液（0.1mol/L)滴定，至溶液顯藍色，在30秒內(nèi)不褪。每1ml碘滴定液(0.1mol/L)相當(dāng)于8.806mg的C₆H₈O₆.

復(fù)習(xí)舊課（3min)

作業(yè)解析(5min)引入新課(2min)

30min

板書計算演示

基本內(nèi)容

注解（進展、輔助

手段和時間分配)

（1)酸性環(huán)境  稀醋酸

   減慢VitC被O2氧化速度

（2)新沸冷H2O 趕走水中O2

（3)立即滴定   減少O2的干擾

（4)附加劑干擾的排除

   片劑 —— 滑石粉 —— 過濾

   注射劑 —— 抗氧劑 ——丙酮、甲醛

（二)2，6 - 二氯靛酚鈉滴定法法

USP  JP

1、原理

2、方法

自身指示終點法

基本內(nèi)容

注解（進展、輔助

手段和時間分配)

（1)酸性環(huán)境 HPO3-HAc

穩(wěn)定VitC

（2)快速滴定 2min內(nèi)

  防止其他還原性物質(zhì)干擾

（3)剩余比色測定  

（4)缺點

不穩(wěn)定 需經(jīng)常標(biāo)定

貯存≤一周

干擾多 氧化力較強

（三)HPLC法

1、HPLC的優(yōu)點

靈敏度高  微量分析

選擇性高  干擾少

分離分析同步  快速

2、HPLC法分離VitC常用方法及測定對象 

方法  離子交換色譜法

離子對色譜法

分配色譜法（正、反相)

    對象  制劑、生物樣品、果汁

血、尿、組織、細胞等

基本內(nèi)容

注解（進展、輔助

手段和時間分配)

   色譜柱  ODS

流動相  A、水 -甲醇（4  ：1)

  B、甲醇

 （梯度洗脫)

抗氧劑 二巰基丙烷磺酸鈉

  水溶性維生素

    離子對色譜法（樟腦磺酸)

    內(nèi)標(biāo)法 + 校正因子

    內(nèi)標(biāo)物——苯酚

脂溶性維生素  外標(biāo)法

第四節(jié)   維生素D的分析

一、結(jié)構(gòu)與性質(zhì)

維生素D₂為9,10-開環(huán)麥角甾-5,7，10(19)，22-四烯-3β-醇，又名骨化醇(calcifyerol)或麥角骨化醇(ergocalciferol)。

維生素D₃為9，10開環(huán)膽甾-5,7，10(19)-三烯-3β-醇，又名膽骨化醇(colecalciferol)。

二者差別僅是維生素D₂比維生素D₃在側(cè)鏈?zhǔn)嵌嘁粋�雙鍵，C₂₄上多一個甲基。

5min

基本內(nèi)容

注解（進展、輔助

手段和時間分配)

1、性質(zhì)  無色針狀結(jié)晶或白色結(jié)晶性粉末；無臭，無味；遇光、空氣易變質(zhì)。

2、溶解性  易溶于有機溶劑，略溶于植物油，不溶于水。

3、不穩(wěn)定性  含多個烯鍵，遇光、空氣或其它氧化劑易氧化變質(zhì)；對酸也不穩(wěn)定。

4、旋光性  維生素D₂具6個手性碳原子，維生素D₃具5個手性碳原子，均具旋光性。

5、顯色反應(yīng) 

6、紫外吸收特性 濃度10μg/ml，256nm

   維生素D2   =460～490；

   　　維生素D3   =465～495。

二、鑒別試驗

(一)顯色反應(yīng)

1、與醋酐-濃硫酸反應(yīng)   Ch.P(2005)

^{【鑒別】  (1) 取本品約0.5mg ，加氯仿5ml 溶解后，加醋酐0.3ml 與硫酸0.1ml,}

^{振搖，初顯黃色，漸變紅色，迅即變?yōu)樽仙�，最后成綠色。}  

2、與三氯化銻反應(yīng) 

3、其它顯色反應(yīng)  與三氯化鐵-----橙黃色

  與二氯丙醇和乙酰氯試劑-------綠色

(二) 比旋度鑒別  Ch.P(2005)  性狀項下：

維生素D₂

^{比旋度  取本品，精密稱定，加無水乙醇溶解并定量稀釋制成每1ml 中含40mg的溶液，依法測定（附錄Ⅵ E)，比旋度為+102.5°至+107.5℃（應(yīng)于容器開啟后30分鐘內(nèi)取樣，并在溶液配制后30分鐘內(nèi)測定)。}

^維生素D3 

^{比旋度  取本品，精密稱定，加無水乙醇溶解并定量稀釋制成每1ml 中含5mg 的溶液，依法測定（附錄Ⅵ E)，比旋度為+105至+112°（應(yīng)于容器開啟后30分鐘內(nèi)取樣，并在溶液配制后30分鐘內(nèi)測定)。}

(三) 其他鑒別方法

TLC、HPLC、衍生物熔點、UV、IR

5min

基本內(nèi)容

注解（進展、輔助

手段和時間分配)

(四)維生素D₂、D₃的區(qū)別反應(yīng)

討論：維生素C碘量法的測量相差關(guān)內(nèi)容。

課間休息十分鐘

三、雜質(zhì)檢查

(一)麥角甾醇檢查

維生素D₂ [Ch.P(2005)]

^{維生素D3無檢查項。}

^{(二)前維生素D的光照產(chǎn)物}

^{D族維生素都是甾醇衍生物，只是側(cè)鏈不同。}

^{維生素D2、D3分別從5,7-二烯甾醇前體7-氫膽甾醇和麥角甾醇的光照而得。}  

5min

基本內(nèi)容

注解（進展、輔助

手段和時間分配)

USP(24)：化學(xué)法、色譜法和微生物法

BP(2000)：化學(xué)法、光譜法和色譜法

Ch.P(2005)：RHPLC

(一)維生素D測定法

本法系用高效液相色譜法(附錄Ⅴ Ｄ)測定維生素D(包括維生素D₂和D₃,下同)及其制劑、維生素AD制劑或魚肝油中所含維生素D及前維生素D經(jīng)折算成維生素D的總量，以單位表示，每單位相當(dāng)于維生素D0.025μg。

Ch.P(2005)：

維生素D₂含量測定：

^{【含量測定】  精密稱取本品25mg，置100ml 棕色量瓶中，加三甲基戊烷80ml，避免加熱，用超聲處理助溶1 分鐘使完全溶解，加三甲基戊烷至刻度，搖勻；精密量取上述溶液與內(nèi)標(biāo)溶液各5ml ，置50ml棕色量瓶中，加正己烷至刻度，搖勻，作為供試品溶液。照維生素Ｄ測定法（附錄Ⅶ K 第一法)測定，即得。}  

^{維生素D3含量測定 :}

^{【含量測定】  精密稱取本品25mg，置100ml 棕色量瓶中，加三甲基戊烷80ml，避免加熱，用超聲處理1分鐘使完全溶解，加三甲基戊烷至刻度，搖勻，作為供試品溶液。照維生素Ｄ測定法（附錄Ⅶ K 第一法)測定，即得。}    

測定應(yīng)在半暗室中及避免氧化的情況下進行。 

10min

基本內(nèi)容

注解（進展、輔助

手段和時間分配)

^第一法   

^{對照品貯備溶液的制備  根據(jù)各制劑中所含維生素D的成分,精密稱取相應(yīng)的維生素D2或D3對照品25mg,置100ml棕色量瓶中，加異辛烷80ml，避免加熱，用超聲處理助溶1分鐘使完全溶解，加異辛烷至刻度，搖勻，充氮密塞，避光，0℃以下保存。}

^{測定維生素D2時，應(yīng)另取維生素D3對照品25mg，同法制成維生素D3對照品貯備溶液，供系統(tǒng)適用性試驗用。}

^{內(nèi)標(biāo)溶液的制備  稱取鄰苯二甲酸二甲酯25mg，置25ml量瓶中，加正己烷至刻度，搖勻。}  

^{色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗  用硅膠為填充劑，正己烷－正戊醇（997∶3)為流動相，檢測波長為254nm。量取維生素D3對照品貯備溶液5ml，置具塞玻璃容器中，通氮后密塞，置90℃水浴中加熱1小時，取出迅速冷卻，加正己烷5ml， 搖勻，置1cm具塞石英吸收池中，在2支8W主波長分別為254nm和365nm的紫外光燈下， 將石英吸收池斜放成45°,并距燈管5～6cm,照射5分鐘,使溶液中含有前維生素D3、反式維生素D3、維生素D3和速甾醇D3；取此溶液注入液相色譜儀，測定維生素D3的峰值，先后進樣5次,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差應(yīng)不大于2.0％；前維生素D3(與維生素D3的比保留時間約為0.5)與反式維生素D3(與維生素D3的比保留時間約為 0.6)以及維生素D3與速甾醇D3(與維生素D3的比保留時間約為1.1)的峰分離度均應(yīng)大于1.0。}

^{校正因子測定  精密量取對照品貯備溶液和內(nèi)標(biāo)溶液各5ml,置50ml量瓶中，加正己烷至刻度，搖勻；取一定量注入液相色譜儀，計算維生素D的校正因子f1。}

^{另精密量取對照品貯備溶液5ml置50ml量瓶中，加入2,6－二叔丁基對甲酚結(jié)晶1粒,通氮排除空氣后，密塞，置90℃水浴中加熱1．5小時，取出迅速冷卻至室溫，精密加內(nèi)標(biāo)溶液5ml，加正己烷至刻度，搖勻；取一定量注入液相色譜儀，計算前維生素D折算成維生素D的校正因子f2。}

^{f2＝(Asmr－f1msAr1)／Ar2ms}

^{式中  As為內(nèi)標(biāo)的峰值；}  

^{mr為加入對照品的量；}     

^{f1為維生素D的校正因子；}

^{ms為加入內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的量；}  

^{Ar1為維生素D的峰值；}

^{Ar2為前維生素D的峰值。}

^{含量測定  取各該制劑項下制備的供試品溶液進行測定,按下列公式計算維生素D及前維生素D折算成維生素D的總量(mi)。}  

基本內(nèi)容

注解（進展、輔助

手段和時間分配)

^{式中  Ai1為維生素D的峰值；}  

^{Ai2為前維生素D的峰值；}

^{ms為加入內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的量；} 

^{As為內(nèi)標(biāo)的峰值。} 

^第二法  

^{精密稱取供試品適量(相當(dāng)于維生素D總量600單位以上，重量不超過2.0g)，置皂化瓶中，加乙醇30ml、抗壞血酸0.2g與50％(g／g)氫氧化鉀溶液3ml[若供試量為3g，則加50％(g／g)氫氧化鉀溶液4ml]，置水浴上加熱回流30分鐘，冷卻后，自冷凝管頂端加水10ml沖洗冷凝管內(nèi)壁，將皂化液移至分液漏斗中，皂化瓶用水60～100ml分?jǐn)?shù)次洗滌,洗液并入分液漏斗中，用不含過氧化物的乙醚振搖提取3次，第一次60ml,以后每次40ml，合并乙醚液，用水洗滌數(shù)次，每次約100ml，洗滌時應(yīng)緩緩旋動，避免乳化,直至水層遇酚酞指示液不再顯紅色，靜置，分取乙醚提取液，加入干燥濾紙條少許振搖除去乙醚提取液中殘留的水分，分液漏斗及濾紙條再用少量乙醚洗滌，洗液與提取液合并，置具塞圓底燒瓶中，在水浴上低溫蒸發(fā)至約5ml，再用氮氣流吹干，迅速精密加入甲醇3ml，密塞，超聲處理助溶后，移入離心管中，離心，取上清液作為供試品溶液A。}

^{凈化用色譜柱系統(tǒng)分離收集維生素D  精密量取上述供試品溶液A 500μl,注入以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑的液相色譜柱，以甲醇－乙腈－水(50∶50∶2) 為流動相進行分離，檢測波長為254nm，從計錄儀上觀察色譜圖，要求維生素D與前維生素D為疊峰，并能與維生素A及其他干擾含量測定的雜質(zhì)分開；準(zhǔn)確收集含有維生素D及前維生素D混合物的全部流出液，置具塞圓底燒瓶中，用氮氣流迅速吹干,精密加入已知內(nèi)標(biāo)濃度的正己烷溶液適量(不少于2ml，并使每1ml中含維生素D為50～140單位,內(nèi)標(biāo)物質(zhì)與維生素D的重量比約為4∶1)，密塞，超聲處理助溶，即為供試品溶液B。}

^{取供試品溶液B，按第一法進行含量測定，進樣量為100～200μl。} 

^第三法  

^{供試品溶液的制備  取各該制劑項下制備的供試品溶液A,按上述第二法凈化用色譜柱系統(tǒng)分離維生素D項下的方法處理,至“用氮氣流迅速吹干”后, 加入異辛烷2ml溶解,通氮排除空氣后，密塞，置90℃水浴中，加熱1.5小時后，立即通氮在2分鐘內(nèi)吹干，迅速精密加入正己烷2ml，溶解后，即為供試品溶液C。}

^{對照品溶液的制備  精密量取對照品貯備溶液適量,加異辛烷定量稀釋制成每1ml中約含維生素D 50單位，精密量取2ml置具塞圓底燒瓶中，照供試品溶液制備項下的方法,自“通氮排除空氣后”起，依法操作，得對照品溶液。}

^{含量測定  在上述第一法的色譜條件下，取對照品溶液與供試品溶液C,交替精密進樣200μl，量取維生素D的峰值，按外標(biāo)法計算含量。}

基本內(nèi)容

注解（進展、輔助

手段和時間分配)

第五節(jié) 維生素E

　　　　　　　　　　　　苯并－二氫吡喃醇

名　　稱　　　　　　　R₁　　R₂　　　　相對活性

α-生育酚　　　　　　CH3　　　　　CH3　　　　1.0　

β-生育酚   CH3  H 0.5

γ-生育酚 H   CH3　　　　0.2

δ-生育酚　　　　　　 H H 0.1

生物效價

   右旋體 ： 消旋體   =  1.4 ：10

（天然品)   （合成品)

dl－α－生育酚醋酸酯

基本內(nèi)容

注解（進展、輔助

手段和時間分配)

苯環(huán) + 二氫吡喃環(huán) + 飽和烴鏈

1、易溶于有機溶劑，不溶于水

2、UV

3、酯鍵   易水解

二、鑒別

(一)硝酸反應(yīng)

取本品約30mg，加無水乙醇10ml溶解后，加硝酸2ml，搖勻，在75℃加熱15分鐘，溶液應(yīng)顯橙紅色。

（二)三氯化鐵－聯(lián)吡啶反應(yīng)

5min

5min

基本內(nèi)容

注解（進展、輔助

手段和時間分配)

（三)UV法

0.01%無水乙醇中

λmax = 284nm

λmin = 254nm

= 41.0～45.5

（四)TLC法

薄層板  硅膠G

展開劑  環(huán)己烷 -乙醚（4  ：1)

　　　 顯色劑  硫酸（105℃  5′)

　　　 VitE    R_f  = 0.7

三、檢查 游離生育酚 

（一)原理

利用游離生育酚的還原性，將硫酸鈰還原成硫酸亞鈰

5min

基本內(nèi)容

注解（進展、輔助

手段和時間分配)

硫酸鈰滴定液（0.01mol/L)

二苯胺（亮黃→灰紫)

　　�。∕生育酚= 430.8)

例：取本品0.10g，加無水乙醇5ml溶解后，加二苯胺試液1滴，用硫酸鈰液（0.01mol/L)滴定，消耗硫酸鈰液（0.01mol/L)不得過 1.0ml。

（三)限量  ≤2.15％

藥典規(guī)定

消耗硫酸鈰液（0.01mol/L)≤1.0ml

若硫酸鈰液濃度不是0.01000mol/L，

應(yīng)重新計算硫酸鈰的消耗量

設(shè)：應(yīng)消耗硫酸鈰液≤ V ml

0.01×1.0 ＝實際濃度× V

例 Ce(SO4)2 = 0.01020mol/L

（四)含量測定

（一)GC法

1、GC特點

選擇性好 靈敏度高 速度快 分離效能好

揮發(fā)性低、不穩(wěn)定、極性強→衍生化易受樣品蒸氣壓限制

10min

哪些物質(zhì)可采用GC法。

基本內(nèi)容

注解（進展、輔助

手段和時間分配)

載氣→N2

固定液→硅酮（OV-17)

擔(dān)體→硅藻土或高分子多孔小球

柱溫→265℃

檢測器→氫火焰離子化檢測　　　器(FID)

內(nèi)標(biāo)→正三十二烷

 　　n ≥ 500

 　　R≥2

內(nèi)標(biāo)法

供試液（樣品+內(nèi)標(biāo))

對照液（對照+內(nèi)標(biāo))

是樣品中不存在的物質(zhì)

與被測組分峰靠近

內(nèi)標(biāo)物　　　能與各組分完全分離

與被測組分的量接近

校正因子

基本內(nèi)容

注解（進展、輔助

手段和時間分配)

例：內(nèi)標(biāo)液  取正三十二烷加正己烷溶解并稀釋成1.0mg/ml溶液.

對照液  精密稱取VitE對照品0.2011g置棕色具塞錐形瓶中，精密加入內(nèi)標(biāo)液10ml，密塞，振搖使溶解，取1~3ul注入GC儀，測定，計算.

供試液  精密稱取供試品0.1998g置棕色具塞錐形瓶中，精密加入內(nèi)標(biāo)液10ml，密塞，振搖使溶解，取1~3ul注入GC儀，測定，計算。

對照液  

供試液

本品含C31H52O3應(yīng)為96.0 ~ 102.0%。  

BP GC 

內(nèi)標(biāo) 正三十二烷

R≥1.4

USP GC 

  內(nèi)標(biāo) 十六酸十六醇酯

  R≥1.0

JP   HPLC 

  外標(biāo)  dl－α－生育酚

R≥1.4   

什么是內(nèi)參照峰？其要求是什么?

基本內(nèi)容

注解（進展、輔助

手段和時間分配)

1、原理  利用生育酚的易氧化性

2、指示劑

  二苯胺（亮黃  →  灰紫)

   還原型　　氧化型

3、討論

A、反應(yīng)速度

分子量較大，

反應(yīng)慢易被O2氧化　　　　　25滴/10s

B、溶劑

Ce(SO4)2易溶于水

生育酚易溶于醇  　　　　 乙醇＋水

C、酸性條件

防止Ce(SO4)2的水解

減慢生育酚被O2氧化速度 　 H2SO4

4、含量計算

MVitE  =  472

（三)JP - RP - HPLC法（外標(biāo)法)

樣品→ dl－α－生育酚

固定相→十八烷基硅烷鍵合硅膠

流動相→甲醇-水（49  ：1)

檢測波長→292nm

   R＞2.6

   RSD≤0.8%　　

計算過程板書分步演示。

基本內(nèi)容

注解（進展、輔助

手段和時間分配)

測定對象→血清中VitA和VitE

固定相→十八烷基硅烷鍵合硅膠

流動相→甲醇-水（96  ：4)

檢測波長→  8′前330nm

8′后292nm

問題討論(5min)

作業(yè)和習(xí)題布置(2min)

歸納總結(jié)(3min)

小 結(jié)

本次課主要講授了①維生素C的含量測定方法，主要為碘量法(掌握)；②維生素D含量測定的第一法；③維生素E的結(jié)構(gòu)、性質(zhì)及檢查。

復(fù)習(xí)思考題

或

作 業(yè) 題

1、維生素C碘量法含量測定中需注意的事項。

2、維生素D₂、D₃的區(qū)別反應(yīng)。

3、維生素E的鑒別試驗。

4、維生素D要進行哪幾項特殊雜質(zhì)的檢查？

教 學(xué) 效 果

與 分 析

多媒體教學(xué)和板書相結(jié)合，并結(jié)合一定的實例，加深學(xué)生對知識點的認識和了解。特別是通過問題討論，讓大家對所學(xué)知識進行回顧、討論，建立一個互動的教學(xué)氛圍。效果較好。