光鏡免疫金銀細(xì)胞化學(xué)方法

　　五、在IGSS染色中常見(jiàn)技術(shù)問(wèn)題和對(duì)策

　�。ㄒ�)背景染色產(chǎn)生的原因和防止方法

　�。�1)第一抗體或金標(biāo)抗體稀釋度不合適，一般容易犯抗體使用過(guò)濃的毛病，認(rèn)為抗體越濃越好，結(jié)果適得其反。應(yīng)該先作方陣滴定，優(yōu)選最佳稀釋倍數(shù)（見(jiàn)第一章　)，即可避免非特異性染色，又可節(jié)　省抗體。

　　（2)使用正常箅清封閉和在抗體稀釋液中加入牛血清白蛋白，可以減少非特異吸附，降低背景染色。

　　（3)顯色的器皿必須徹底清洗，化學(xué)試劑必需用三蒸餾水配制。

　�。�4)乳酸銀和硝酸銀的顯色在避光的環(huán)境中反應(yīng)。醋酸銀則可在有光的環(huán)境中顯色。

　　（5)顯色時(shí)切片應(yīng)垂直放置在銀顯影液中，使過(guò)多的銀顆粒下沉，如水平放置易沉淀于切片上。

　�。�6)控制反應(yīng)時(shí)間，顯影液加入適量的阿拉伯膠或明膠可以延緩反應(yīng)速度，避免形成過(guò)多的還原銀，非特異地吸附在切片上。一般加入明膠1%～2%，效果比較滿(mǎn)意，反應(yīng)時(shí)間根據(jù)室溫而定，室溫25^℃左右顯色時(shí)間10～15min，室溫在20℃以下，顯色時(shí)間20～30min左右。

　�。�7)洗滌：使用TBS時(shí)最好加入0.05%～0.1%的Triton X-100或Tween 80，可以洗脫掉組織表面發(fā)生非特異性吸附的污染蛋白，防止出現(xiàn)背景的非特異染色。

　�。ǘ�)背景染色已發(fā)生應(yīng)如何消除

　　（1)2%硫代硫酸鈉，1%鐵氰化鉀等量混合，加在切片上至背景無(wú)色為止。

　　（2)2%鐵氰化鉀和1%溴化鉀等量混合作用1min水沖洗，然后加上2%硫代硫酸鈉和1%亞硫酸鈉脫色，至背景干凈為止。

　　（3)0.1%重鉻酸鉀加0.25%濃硫酸，在顯微鏡下控制脫色時(shí)間，至陽(yáng)性結(jié)果清楚，無(wú)背景為止。然后用5%硫代硫酸鈉漂白。注意時(shí)間不要過(guò)長(zhǎng)，以免陽(yáng)性結(jié)果被脫掉。

　�。�4)用0.3%～1%的H₂O₂ 處理切片也可消除背景的銀顆粒。但必須在顯微鏡下控制脫水時(shí)間，防止把陽(yáng)性結(jié)果脫色。

　�。ㄈ�)彩色顯影背景過(guò)染的處理方法

　　彩色免疫金銀法，在膠體金技術(shù)中是一個(gè)很大的突破，它的優(yōu)點(diǎn)是結(jié)果鮮明，對(duì)比度好，但是在彩色顯影過(guò)程中時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，背景可有一些著色，彩色顯影的時(shí)間控制很重要。一旦過(guò)染可用以下方法處理。

　�。�1)純酒精滴到切片上3～5s,立即沖掉，水洗，充分地把酒精洗掉，如果洗不徹底，造成陽(yáng)性結(jié)果脫色。

　�。�2)75%的酒精滴到切片上1min，立即沖掉，脫色不能時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，過(guò)長(zhǎng)后陽(yáng)性結(jié)果全部脫掉。

　　六、物理顯影液及緩沖液的配制

　�。ㄒ�)緩沖液的配制

　�。�1)0.05mol/l pH7.4 TBS 配制

　　Tris（三羥甲基胺基甲烷)12.1g

　　NaCl 　　　　　　　　　　17.5g

　　加雙蒸水　　　　　　　　1900ml

　　然后用濃HCL調(diào)至pH為7.4再加雙蒸水至2000ml

　　Tris 　　　　　　　4.84g

　　NaCl 　　　　　　　17.5g

　　BSA 　　　　　　　　2.0g

　　NaN₃ 1.0g

　　雙蒸水1900ml,充分?jǐn)嚢柚寥苜|(zhì)完全溶解,用濃HCl調(diào)pH至8.2,再加雙蒸水至2000ml。

　�。ǘ�)銀顯影液的配制

　　1．乳酸銀顯影液的配制：混合以下溶液

　　①10%阿拉伯膠水溶液60ml

　�、阼蹤此峋彌_液pH 3.5 10ml

　�、蹖�(duì)苯二酚1g,加雙蒸水20ml溶解。

　�、苋樗徙y水溶液100 mg加水10ml。

　　注意在暗處顯影。

　　2．硝酸銀顯影液的配制

　　①10%阿拉伯膠水溶液60ml。枸櫞酸緩沖液ph 3.5 10ml

　　②對(duì)苯二酸1.7g水溶液30ml。

　　③硝酸銀40mg水溶液2ml。

　�、佗趦扇芤和耆�溶解，臨用前加入硝酸銀溶液。在暗處顯影。

　　4．彩色顯影液的配制

　�、�0.2N氫氧化鈉的異丙醇溶液5ml溶入100mgα-萘酚（或菲尼酮)。

　�、�500mg碳酸鈉，25mg溴化鉀，50mg亞硫酸鈉，加雙蒸水25ml。

　�、佗趦梢�1：10混合，室溫下彩色顯影。

　　5．醋酸銀顯影液

　�、�15%阿拉伯膠60ml，檸檬酸緩沖液10ml，pH3.5。

　　②對(duì)苯二酚1.7g溶于20ml蒸餾水中。

　�、鄞姿徙y100mg溶于蒸餾水10ml中。

　　用前①②③依次混合，不需要避光，在室溫下顯影。

　�。ㄈ�)檸檬酸緩沖液的配制

　　檸檬酸（C₆H₈O₇.H₂O)25.5g

　　檸檬酸三鈉（Na₃C₆H₅O₇.2H₂O)23.5g

　　加重蒸水100ml溶解即成，pH3.5

　　(四)氫氧化鈉（NaOH)無(wú)水乙醇飽和溶液的配制　

　　8g氫氧化鈉，加入100ml無(wú)水乙醇振搖溶解即成。

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