第四章：微生物生長
生長：有機體的細胞組分與結構在量方面的增加。
繁殖：單細胞-由于細胞分裂引起個體數目的增加。
多細胞-通過無性或有性孢子使個體數目增加的過程。
發(fā)育：適合條件下，生長與繁殖始終是交替進行的，從生長到繁殖是一個由量變到質變的過程，這個過程稱為發(fā)育。
1節(jié)：微生物的發(fā)育周期
一、概念
發(fā)育周期、單細胞微生物、絲狀真菌
二、發(fā)育周期中細胞學上變化
1、細胞壁與質膜的延伸
質膜合成位點在赤道帶，細胞壁生長也定位在赤道區(qū)，并具有種的特異性。
2、DNA的復制
1）單向復制 John Cairns：E. Coli作材料，放射自顯影技術。染色體從起始點開始，反時針旋轉一周完成。
2）雙向復制 Hiroshi Yoshikawa：不只按一個方向復制，起點與終點不重合。
3）滾環(huán)模型：不對稱復制。一股線狀，一股環(huán)狀復制。
真核微生物復制有多個位點，都是雙向。
3、發(fā)育循環(huán)中基因的表達
DNA的復制與細胞分裂是協(xié)調的。細胞分裂總是發(fā)生在DNA復制后的一定時間內。抑制DNA合成的各種化學處理或突變也抑制細胞分裂。細菌DNA復制需DNA起始蛋白作用。
E. coli 細胞分裂總是發(fā)生在DNA復制完成后大約20分鐘，而DNA復制需40分鐘，這樣世代時間應是60分鐘，但…...
三、細胞分化現象
在某些微生物的發(fā)育循環(huán)中，一個或一群細胞會從一種形態(tài)與功能轉變?yōu)榱硪环N形態(tài)與功能，此稱細胞分化或形態(tài)發(fā)生。
2節(jié)：微生物純培養(yǎng)的生長
一、純培養(yǎng)的分離方法 表
二、生長測定（適用、注意事項）
直接計數法（全數）
間接計數法（活菌數）
測細胞物質量
三、細菌純培養(yǎng)群體生長規(guī)律
將少量純培養(yǎng)接種到一恒定體積的新鮮液體培養(yǎng)基中，適宜條件下培養(yǎng)，定時取樣測定細菌含量，以培養(yǎng)時間為橫坐標，以細菌數目的對數或生長速率為縱坐標，得繁殖曲線，對單細胞而言，又稱生長曲線。
根據生長速率不同，分為幾個時期。
（一）延遲期 lag phase(停滯期、調整期）
表現：不立即繁殖，生長速率近于0，菌數幾乎不變，細胞形態(tài)變大。
特點：分裂遲緩，合成代謝活躍，體積增長快，對外界不良環(huán)境敏感。
原因：調整代謝，合成新的酶系和中間代謝產物以適應新環(huán)境。
消除：增加接種量；采用最適菌齡接種；培養(yǎng)基成分（種子、發(fā)酵）
（二）對數期 log phase
表現：代謝活性最強，幾何級數增加，代時最短，生長速率最大。
特點：細菌數目增加與原生質總量增加，與菌液濁度增加呈正相關性。
代時（generation time）：單個細胞完成一次分裂所需時間，亦即增加一代所需時間。

G=t1-t0/n y=x•2n n=lgy - lgx/lg2
導出 G = t1 - t0 /3.3(lgy - lgx)
影響G因素：菌種、營養(yǎng)成分、營養(yǎng)物濃度（很低時影響）、培養(yǎng)溫度。
（三）穩(wěn)定期 stationary phase(最高生長期、靜止期）
表現：新增殖細胞數與老細胞的死亡數幾乎相等，活菌數動態(tài)平衡。
特點：生長速率又趨于0，細胞總數最高。
原因：養(yǎng)分減少；有毒代謝物產生。
穩(wěn)定期細胞內開始積累貯存物，此階段收獲菌體，也是發(fā)酵過程積累代謝產物的重要階段。
延長：補料，調pH、溫度等。
此時，菌體總數量與所消耗的營養(yǎng)物之間存在一定關系，稱為產量常數（生長效率）。Y = X - X0 /C 其中X-穩(wěn)定期細胞干重/ml， X0 -接種時干重/ml，C-限制性營養(yǎng)物濃度。
根據這一原理，可進行生物測定。
將未知混合物加到只缺乏特定限制性營養(yǎng)物的完全培養(yǎng)基中，測定培養(yǎng)基所能達到的生長量，就可以計算出原混合物中特定限制性營養(yǎng)物的濃度。
（四）衰亡期 decline phase
表現：出現 “負生長 ”，有些細胞開始自溶。
對于絲狀真菌，細胞數目不呈幾何級數增加，無對數生長期，一般有調整期，最高生長期，衰退期。
四、連續(xù)培養(yǎng) continuous cultivation
分批培養(yǎng) batch culture ：將微生物置于一定容積的培養(yǎng)基中，經過培養(yǎng)生長，最后一次收獲。
若不斷補充新鮮營養(yǎng)，并及時不斷以同樣速度排出培養(yǎng)物，則可延長對數期。
只要培養(yǎng)液的流動量能使增殖的新菌數相當于流出的老菌數，就可保證總菌量不變，此即連續(xù)培養(yǎng)原理。
主要參數：D（稀釋率）=F（流動速率）/V（容積）
連續(xù)培養(yǎng)方法
1、恒濁連續(xù)培養(yǎng) turbidostat
不斷調節(jié)流速使培養(yǎng)液濁度保持恒定。
裝置
適用：收獲菌體及與菌體相平行的產物。
2、恒化連續(xù)培養(yǎng) chemostat
恒定流速，及時補充營養(yǎng)，營養(yǎng)物濃度基本恒定，從而保持恒定生長速率。又稱恒組成連續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)基成分中，必須將某種必需的營養(yǎng)物控制在較低的濃度，以作為限制性因子，而其它營養(yǎng)物過量。常用的有氨、氨基酸、葡萄糖、生長因子、無機鹽等。
適用；科研
兩種方法比較：
五、同步生長 synchronous growth
概念：使所有的細胞都能處于同一生長階段，同時分裂的生長方式。
同步培養(yǎng)法獲得：
（一）機械法（選擇法）
1、離心沉降分離法
2、過濾分離法
3、硝酸纖維素薄膜法
（二）調整生理條件法（誘導法）
1、溫度調整法：亞適生長溫度-->最適生長溫度培養(yǎng)。
2、營養(yǎng)條件調整法：控制濃度或組成，使細胞只能進行一次分裂。
3、用穩(wěn)定期的培養(yǎng)物接種：穩(wěn)定期細胞處于衰老狀態(tài)，移入新鮮培養(yǎng)基，可得同步生長。
（三）抑制DNA合成法
DNA合成是細胞分裂前提。抑制一段時間再解除抑制。
3節(jié)：環(huán)境條件對生長影響
一、溫度
影響兩方面。
最低、最適、最高生長溫度，致死溫度。
微生物生長溫度類型：
低溫型（嗜冷微生物）
中溫型（嗜溫微生物）
高溫型（嗜熱微生物）
二、pH
主要影響：引起膜電荷變化，從而影響營養(yǎng)吸收；影響酶活性；改變營養(yǎng)物狀態(tài)和有害物毒性。
有最適pH，此時酶活性最高，其他條件適合，生長速率最高，但不是生產的最適pH。
微生物細胞內的pH多接近于中性。
pH調節(jié)措施：
三、氧化還原電位 Eh
Eh與氧分壓有關，也與pH有關。
不同種類微生物所要求的Eh不同。
Eh影響酶活性，也影響呼吸作用。
四、輻射
指通過空氣或外層空間以波動方式從一個地方傳播或傳遞到另一個地方的能量。
（一）紫外線（非電離輻射）10-380nm
致死主要是細胞中很多物質對紫外線吸收。殺菌作用隨劑量增加而增加。紫外線穿透力弱，應用于空氣消毒、表面消毒、菌種誘變。
（二）電離輻射（X、α、β、γ）
效應無專一性， α、β穿透力較弱，X、 γ較強。
KI對電離輻射具保護作用。
五、干燥
水分對正常生長必不可少，各種微生物抵抗干燥能力不同。
六、滲透壓
微生物對滲透壓有一定適應能力。高滲溶液—質壁分離，低滲溶液—細胞膨脹破裂。
七、超聲波（20，000Hz以上）
使細胞破裂，科研中破碎細胞。
八、表面張力
4.5--6.5x10-4 N/cm，降低影響。
4節(jié)：滅菌與消毒
滅菌 sterilization ：殺死所有微生物。
消毒 disinfection ：殺死一切病原微生物。
防腐 antisepsis：利用理化因素抑制微生物生長繁殖。
化療 chemotherapy：利用具有選擇毒性化學藥物或抗生素來抑制宿主體內病原微生物的生長繁殖，借以達到治療的一種措施。

一、常用滅菌消毒方法
1、干熱滅菌法
火焰滅菌（灼燒滅菌）、干熱滅菌
2、濕熱滅菌
巴氏消毒、煮沸消毒、高壓蒸汽滅菌、間歇加熱滅菌、實罐滅菌
3、過濾除菌
4、放射線滅菌
二、常用的消毒劑
理想的消毒劑：殺菌力強，使用方便；價廉；對人、畜無害；能長期保存；溶解度大；無腐蝕性等。
消毒劑種類：氧化劑、重金屬鹽、有機化合物
相對藥效：
三、影響滅菌與消毒因素
1、微生物種類
2、培養(yǎng)基
3、消毒劑
4、環(huán)境因素
5節(jié)：化學療劑對微生物作用
能直接干擾病原微生物的生長繁殖并可用于治療感染性疾病的化學藥物。
化學療劑能選擇性地作用于病原微生物新陳代謝的某個環(huán)節(jié)，使其生長受到抑制或致死。
一、抗代謝物
結構上類似，競爭性地與酶結合，只有當正常代謝物量少或不存在時才起作用。
最常用的是磺胺類藥物。是氨苯磺胺衍生物，其結構與對氨基苯甲酸（PABA）類似，而PABA是葉酸分子組成。葉酸是輔酶，在氨基酸、維生素合成中起重要作用，許多細菌需自己合成葉酸，而人和動物利用現成葉酸，因此不受磺胺干擾。
還有異煙肼rimifon，是吡哆醇對抗物。
二、抗生素
作用范圍：抗菌譜
作用位點：
1、抑制細胞壁合成：青霉素，多氧霉素
2、影響細胞膜功能：多肽類，多烯類
3、干擾蛋白合成：抑制而非殺死
4、阻礙核酸合成：對細胞有毒
三、微生物抗藥性
對藥物的適應性即是抗藥性。
抗藥性主要表現（產生機制）
1、菌體內產生鈍化或分解藥物的酶
2、改變膜的透性而導致抗藥性產生
3、被藥物作用的部位發(fā)生改變
4、形成救護途徑。
五章：微生物遺傳
遺傳heredity—親代將其特有的生物學特性傳遞給子代。
遺傳性—子代總保持與親代相同的生物學特性。
遺傳型genotype—生物體所具有的全套遺傳物質總稱。又稱基因型。
表型phenotype—特定環(huán)境中生物體表現出的種種形態(tài)與生理特征。
變異variation— 遺傳型的改變。
適應或飾變modification—表型的改變。
基因—指帶有足以決定一個蛋白質全部組成所需信息的最短DNA片段。
菌株&克隆—指一組遺傳型相同的細胞群。
微生物在遺傳上特點：
1、微生物細胞結構簡單，營養(yǎng)體一般為單倍體，方便建立純系。
2、很多常見微生物都易于人工培養(yǎng)，快速、大量生長繁殖。
3、對環(huán)境因素的作用敏感，易于獲得各類突變株，操作性強。大多是無性生殖，變異易保留。
1節(jié)：遺傳變異的物質基礎
一、證明經典實驗
（一）轉化實驗
1928，Griffith首次發(fā)現Streptococcus pneumoniae的轉化現象。
1944，Avery等在離體條件下重復這一實驗，并對轉化本質進行了研究。
終于證明了DNA是遺傳物質。
Griffith轉化實驗：
Avery轉化實驗
（二）噬菌體T2的感染實驗
1952，Hershey & Chase 用E. coli, phage T2做材料，利用同位素示蹤法進行實驗。
蛋白質只含S不含P，DNA只含P不含S，分別用35S、32P標記E. coli, 用T2感染，得到35ST2、32PT2。
實驗過程（插入）
（三）病毒拆開與重建實驗
1956，Fraenkel & Conrat 用TMV（煙草花葉病毒）和HRV（霍氏車前病毒）進行實驗，說明遺傳信息在RNA中。
（插入）
二、遺傳物質在細胞中存在方式
（一）細胞水平
（二）核水平（plasmid）
（三）染色體水平
（四）核酸水平
（五）基因水平（遺傳功能單位）
（六）密碼子水平（遺傳信息單位）
（七）核苷酸水平（最低突變或交換單位）
染色體外遺傳物質—質粒
染色體外，獨立存在的，能自主復制的遺傳物質。
雙股環(huán)狀DNA，可游離存在，也可整合到宿主DNA上。
吖啶類染料、高溫、某些離子作用可消除質粒。
附加體episome：質粒插入到染色體上和染色體一起復制。
質粒種類
1、F因子（致育因子）：大腸桿菌中發(fā)現，含質粒為F+（♂）；無質粒為F-（♀）；質粒DNA整合到染色體上為Hfr.
2、R因子（耐藥性）：痢疾桿菌，多價耐藥性，耐藥信息攜帶在質粒上。
3、Col因子（大腸桿菌素產生因子）
4、青霉素酶質粒
5、Ti質粒（誘癌質粒）：植物根癌，植物基因工程重要載體。
6、降解質粒：Pseudomonas
隱蔽質粒、表達質粒、分泌質粒等。 ←
2節(jié)：基因突變
突變mutation—遺傳物質核酸中的核苷酸順序突然發(fā)生了可遺傳的變化。
包括基因突變（點突變）—由于DNA鏈上的一對或少數幾對堿基發(fā)生改變而引起。
染色體畸變—DNA的大段變化現象，表現為插入、缺失、重復、易位、倒位。
由于重組或附加體等外源遺傳物質的整合而引起的DNA改變，不屬突變范圍。

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